白细胞介素35的蛋白表达与纯化

发布时间：2017-03-30 09:05

  本文关键词：白细胞介素35的蛋白表达与纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素是人体中参与免疫作用的细胞因子,具有十分重要的生理功能。白细胞介素家族成员众多,其中白细胞介素35(Interleukin-35,IL-35)是一种非常重要的由异源二聚体组成的抑制性细胞因子,属于白细胞介素12家族。在免疫调控中发挥重要作用,IL-35的研究会涉及很多炎症的彻底治愈,机体的免疫耐受性,和自身免疫疾病的治疗等许多方面。白细胞介素35作为最新的抑制性细胞因子,蛋白结构未知成为了后续研究的限制性因素。本研究旨在获得适合晶体解析的白细胞介素35及其受体的蛋白,构建了原核表达系统中适合表达白细胞介素35单个亚基克隆表达载体以及真核细胞表达系统中适合表达白细胞介素35单个亚基和融合蛋白的克隆表达载体,使白细胞介素35及其受体gp130可以稳定表达。在原核表达系统中纯化了包涵体蛋白及可溶蛋白,包涵体蛋白复性失败,纯化可溶蛋白能够获得目的蛋白。真核表达系统中,昆虫细胞Sf21细胞和哺乳动物细胞293T细胞中无法进行白细胞介素35单个亚基的表达,融合蛋白表达量过低,仅在蛋白质印迹法中可检测。昆虫细胞High Five中白细胞介素35的α链亚基p35,β链亚基受体蛋白gp130获得了较好的表达。在获取目的蛋白的过程中,首先采用了亲和层析完成了对蛋白的初步提取,将得到的初步提取的蛋白进行了离子交换层析,凝胶过滤层析柱分离杂蛋白,本研究最终获得了均一、稳定、折叠良好的白细胞介素35α链亚基IL12α-p35、β链亚基EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3),β链亚基受体gp130的蛋白,为后续的晶体学研究奠定基础。
【关键词】：白细胞介素35 克隆表达载体的构建 原核表达系统 真核表达系统 蛋白表达与纯化
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 第1章 前言8-21
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义8
• 1.2 国内外研究现状分析8-12
• 1.2.1 Interleukin简介8-9
• 1.2.2 Interleukin-35的发现及其研究进展9-12
• 1.2.3 Interleukin-35受体研究进展12
• 1.3 蛋白质的稳定表达及分离纯化12-19
• 1.3.1 真核细胞中分泌蛋白表达纯化14-16
• 1.3.2 原核细菌中胞内可溶蛋白的蛋白表达纯化16-17
• 1.3.3 原核细菌中包涵体蛋白表达纯化17-19
• 1.4 蛋白表达纯化与结构生物学19-20
• 1.5 本文的主要研究内容20-21
• 1.5.1 Interleukin-35克隆表达载体的构建20
• 1.5.2 Interleukin-35蛋白的表达与纯化20-21
• 第2章 实验材料和实验方法21-33
• 2.1 引言21
• 2.2 实验材料21-24
• 2.2.1 质粒和菌株21
• 2.2.2 分子生物学相关的生化试剂21
• 2.2.3 蛋白表达纯化所需试剂21-23
• 2.2.4 实验仪器23-24
• 2.3 实验方法24-32
• 2.3.1 克隆表达载体的构建24-26
• 2.3.2 重组质粒鉴定与测序26-28
• 2.3.3 真核表达系统蛋白表达的检测28-30
• 2.3.4 蛋白的原核表达及纯化30-32
• 2.4 本章小结32-33
• 第3章 白细胞介素 35 克隆表达载体的构建33-47
• 3.1 引言33
• 3.2 真核表达载体的构建33-43
• 3.2.1 单个蛋白真核表达载体的构建33-40
• 3.2.2 融合蛋白表达载体的构建40-43
• 3.3 原核克隆表达载体的构建43-46
• 3.4 本章小结46-47
• 第4章 白细胞介素35蛋白的表达与纯化47-61
• 4.1 引言47
• 4.2 单个蛋白的真核表达纯化47-52
• 4.3 融合蛋白的真核表达纯化52-53
• 4.4 原核蛋白的表达纯化53-60
• 4.4.1 包涵体蛋白表达纯化55-57
• 4.4.2 原核可溶蛋白的纯化57-60
• 4.5 本章小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-66
• 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果66-68
• 致谢68

【共引文献】

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本文编号：276714