针对TLR4基因的短发夹结构表达对RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用

发布时间：2020-09-20 21:46

　　背景近年来发现一种新的受体家族—toll-like receptors(TLRs),可能是控制过度炎症反应的闸门。TLRs(Toll-like receptors)属于Ⅰ类跨膜受体,其胞外区有富含亮氨酸重复序列的结构域(Leucine-rich repeats domain,LRR domain),负责刺激信号识别,而胞内则是称为Toll/IL-1R(TIR)的结构域,与信号的传导相关,TLRs属于识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)的受体,广泛分布于单核巨噬细胞系统、内皮细胞、树突细胞、部分消化道上皮等,其配体包括内毒素(LPS),肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。TLRs的激活将敲响侵入机体微生物的丧钟(toll the bell),它通过识别PAMPs而激活先天性免疫反应途径,并诱导适应性免疫反应的发生。研究表明TLR4或TLR2的激活将引起一系列下游分子的活化,随后激活核转录因子-κB(nuclear factor- kappa B, NF-κB),最终引起以TNF-α等为中心的前炎症因子激活,导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应。因此研究对TLRs的阻断效应可帮助我们寻求一个从源头控制过度炎症反应的扳机点,从而达到有效调控机体过度炎症反应的目的。目的构建针对Toll-like receptor 4 (TLR4) mRNA的发夹结构RNA(small haparin RNA,shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNAi (RNA interference)对内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌的抑制作用,并探讨其对炎症反应的调控机制。方法以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA为基础,运用网络工具设计针对TLR4 mRNA的寡核苷酸片段,克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4,运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7,转染24小时后予新霉素(G418)筛选获取稳定转染细胞株,以荧光相差显微镜观察细胞系中荧光蛋白的表达强度,再运用LPS刺激转染的RAW264.7细胞,采用荧光定量PCR检测其TLR2mRNA的表达,Western blot检测下游关键转录因子NF-κB的表达,并以ELISA法检测细胞系分泌炎症因子的水平变化。结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4分别用BbsⅠ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4.9kb和340bp的的条带,后者出现5.0kb和220bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确。运用脂质体Lipofectamine 2000将pEGFP-H1/TLR4转染至RAW264.7细胞后,发现增强型荧光蛋白的表达率约为(45.25±9.23)%。获取稳定转染的RAW264.7细胞,运用LPS对其刺激后,其TLR2mRNA的的表达明显低于未转染组细胞,NF-κBp65表达下调,且伴有TNF-α水平的分泌下降。结论针对TLR4 mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用;能降低LPS刺激下的RAW264.7细胞TLR2的表达,NF-κBp65表达下调,并伴有TNF-α分泌的下降。TLR4可能通过某种机制调节TLR2的表达。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2006
【中图分类】：R346
【部分图文】：

序列,Th细胞

图1 APC上的TLR调节Th细胞的分化图2 LPS－TLR途径近年来，RNA干扰技术成为研究热点，预测未来10年间最有可能出重大成果的领域之一。RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护象，是双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达使其沉默的过程。它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录水平，又称为转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNAinduced silencing complex， RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程[6]。（图3）

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RNA作用机制示意图

【参考文献】