人白细胞介素21的克隆表达、及初步纯化和活性测定

发布时间：2020-09-28 07:19

　　 目的 利用基因工程技术从人扁桃体细胞cDNA中克隆出IL-21编码基因，将其N末端成熟片段编码基因在原核细胞中进行融合表达，并进行初步纯化和抗原性检测。 方法 以人扁桃体细胞经PHA刺激的cDNA文库为模板，经PCR获得IL-21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物，经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因。将此IL-21基因插入表达载体pGEX 4T-2并转化大肠杆菌DH5α，重组克隆经酶切与测序确认后进行IPTG诱导表达。用琼脂糖珠结合的纯化和酶切方法，所得产物作蛋白印迹试验分析。 结果 琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论大小相等。SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带。目的蛋白约占总菌体蛋白的10％。并获得了与理论值相符的纯化条带，在进一步的蛋白印迹试验分析中发现表达的蛋白能与IL-2的单抗产生交叉反应。 结论 我们构建了人IL-21编码基因克隆载体并获得在大肠杆菌中的成功表达，同时建立了该蛋白的初步纯化方法，通过免疫印迹实验进一步揭示了表达蛋白与IL-2之间结构的相似性，结合国外最新研究预示了IL-21作为临床一种新的调节免疫功能药物的潜力。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R392
【部分图文】：

图1PCR产物及重组质粒①DLZ000Marker;②IL一21全长编码基因;③IL一21成熟N末端编码基因;④pGEX4T一2空质粒;⑤酶切的pGEX4T一2空质粒;⑥重组成功的pGEX4T一2八L一21质粒测定性(白斑)的IL一21的全长编码基因克隆送测序部(仪器为ABIP租SM377一%，测别用自带引物进行测通。测序结果显示:预期一致，进一步证明重组克隆成功。测序

经PcR扩增出的IL一21成熟肤的编码基因片段，在酶切后插入质粒pGEX4T-2，构建成重组表达质粒。碱裂解法提取重组克隆质粒，首先用PCR初步鉴定重组质粒;然后，将PCR鉴定重组成功的质粒经双酶切后电泳(图2)。4.重组质粒pGEX4T一2/IL一21在E.eo11DH5a中的表达经SDS一PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R一250染色观察，含重组质粒的诱导菌在4100oD。位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的没有蛋白条带;含质粒pGEX4T一2的诱导菌在26000Da位置出现一条带。目的基因表达的多肤相对分子量估计为150O0Da，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为41000Da，与理论估计相一致。经凝胶成像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%。(图3)图3重组质粒表达产物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未诱导的空质粒;③未诱导的重组质粒;④诱导的空质粒;⑤一⑦诱导1，2，4h的重组质粒

与理论估计相一致。经凝胶成像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%。(图3)图3重组质粒表达产物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未诱导的空质粒;③未诱导的重组质粒;④诱导的空质粒;⑤一⑦诱导1，2，4h的重组质粒

【共引文献】

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本文编号：2828498