EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化

发布时间：2020-09-29 11:29

　　神经干细胞具有自我更新能力和多分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等主要类型的神经细胞。虽然脑组织中存在这种具有持续分裂潜能的神经干细胞，但由于其数量少并缺乏足够的正向刺激信号，在损伤条件下无法产生大量新生细胞；存在于成年脑组织内的神经干细胞取材困难；从胚胎干细胞诱导分化而来或直接从胎脑组织中分离而来的神经干细胞又涉及伦理及免疫排斥反应等问题，严重限制了神经干细胞的临床应用。因此，寻找新的神经干细胞的来源对于神经科学领域基础与临床应用研究的发展有着重要意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不仅能够跨胚层向多种组织和细胞类型分化，并且在体外易于分离培养和扩增。这些特性使MSCs成为在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。国内外已有较多实验证明骨髓来源的MSCs(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)在体外可以分化为神经细胞。MSCs不仅存在于骨髓，也存在于脐血和外周血中。近期的研究表明脐血MSCs具有与骨髓MSCs相似的分化为神经细胞的功能。端粒酶的适度低表达是脐血MSCs维持增殖能力的必要条件之一，端粒酶活性的高低可间接反映脐血MSCs的增殖能力和移植的安全性(无致瘤性)。本研究对重组人表皮生长因子(epithelium growth factor，EGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)联合诱导人脐血MSCs体外向神经细胞分化过程中端郑州大学2004届硕士研究生学位论文 EGF和bFGF联合诱导人脐血Mscs向神经细胞分化过程中的端粒醉活性变化粒酶活性变化进行检测，以探讨人脐血MSCs体外向神经细胞分化过程中的增殖性和安全性，为其临床应用提供实验和理论依据。方法: 采集健康自然分娩产妇志愿捐献的脐血，用PBs(P H 7.4)进行l:l稀释，密度梯度离心分离单个核细胞(mononuelear eells，MNCs)，PBS洗涤2次后重悬于含20%胎牛血清的DMEM/F12中，苔盼蓝染色计数，调整细胞数后，接种于T一75 培养瓶内(细胞密度为1 x 106/m1)，一组不加细胞因子，另一组加入EGF和bFGF，终浓度各为10ng/ml，剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以去除未贴壁细胞，以后每3d全量换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。分别收集培养 ld、4d、7d、10d、14d、Zld的贴壁细胞和冻存细胞，PBS洗涤后计数活细胞，将细胞密度调整一致，采用反转录多聚酶链反应(reverse一transcript polymerase chain reaction，RT一PCR)方法检测脐血MSCs培养前后各时IbJ段的巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(neurofilament Sub俪tM，NF一M)和人端粒酶逆转录酶(human telomerase:everse transedPtase，hTERT)mRNA表达;采用端粒重复序列扩增法 (telomerer即eat田的plifieation protoeal assay，TRAp)一酶联免疫吸附实验(ELISA) 法检测人脐血MSCS向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化。结果: 1.RI飞PCR检测发现，未培养的脐血细胞nestin、NF一M、hTERT mRNA均表达阳性。培养后nestin、hTERT mRNA二者表达随培养时间延长而下降，至第7d已不能检出;而NF一M mRNA的表达随培养时间延长而增强。细胞因子组与对照组相比，细胞因子能促进NF一M mRNA的表达，能延缓nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势。 2.TRAP(PCR)一ELISA法检测发现，未培养的脐血细胞端粒酶活性较高，以后随培养时间的延长而下降(尸0.01)，至培养第Zld后已不能检出。细胞因子组与对照组相比，细胞因子能延缓端粒酶活性的降低趋势(P0.01)。结论: 1.细胞因子EGF和bFGF能联合诱导脐血MSCs向神经细胞分化。 2.细胞因子EGF和bFGF在联合诱导脐血MSCs分化为神经细胞的过程中，能下调hTERI，mRNA的表达。郑州大学2侧)4届硕士研究生学位论文 EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒醉活性变化 3.细胞因子EGF和bFGF在联合诱导脐血MSCS向神经细胞分化的过程中，能降低脐血MSCS的端粒酶活性。 4.本实验为脐血MSCs移植治疗神经系统疾病提供了安全方面的理论依据。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329
【部分图文】：

琼脂糖凝胶,人脐血,扫描成像系统,向神经

届硕士研究生学位论文EGF和bFGF联合诱导人脐血MScs向神经细胞分化过NA的质量检查有6%甲醛的琼脂糖凝胶上进行电泳:取5闪加有载样缓冲化乙锭(EB)、质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶中，在电压后，置凝胶扫描成像系统下观测结果并照相。能清楚地看到28SrRNA和18SrRNA两条清晰的条带，也.85rRNA和55rRNA组成的较模糊迁移较快的带。285rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象，说明所提验的要求133](见图l)。

脐血,胞体,时长

3.结果3.1倒置显微镜下观察各组细胞形态培养初期(24h)脐血MSCS胞体小呈圆形(见图2)，以后逐渐变为椭圆、胞体变大(4d)，向两极伸出突起(7d)(见图3)，对照组14d时长成梭形(见图4);细胞因子组14d时长成成纤维状细胞，突起伸出较长，有多个邻近细胞的突起连成网状，类似神经元(见图5)。

3.1倒置显微镜下观察各组细胞形态培养初期(24h)脐血MSCS胞体小呈圆形(见图2)，以后逐渐变为椭圆、胞体变大(4d)，向两极伸出突起(7d)(见图3)，对照组14d时长成梭形(见图4);细胞因子组14d时长成成纤维状细胞，突起伸出较长，有多个邻近细胞的突起连成网状，类似神经元(见图5)。

【参考文献】