应用噬菌体展示随机肽库筛选人甲型流感病毒模拟表位

发布时间：2020-09-30 21:03

　　流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，它对人类危害极大。目前对于流感尚无有效的治疗手段，仍以疫苗接种为主，但由于流感病毒的抗原变异性强，当前使用的三联灭活疫苗效果并不理想，迫切需要研制具有交叉保护作用的新型疫苗。本文应用噬菌体展示随机肽库技术对目前流感病毒的主要流行亚型H1N1和H3N2间有交叉保护作用的模拟表位进行了筛选。主要实验包括： 1．流感病毒模拟表位的筛选与鉴定将原十二肽库在大肠杆菌XL1-Blue中扩增，经PEG／NaCl沉淀纯化，溶于TBS中。以抗H3N2流感病毒的多克隆抗体(100ng／μl)包被酶标板，加入制备好的肽库，用TBST洗去非特异结合的噬菌体，加0.2mol／L甘氨酸-盐酸(pH2.2)，室温放置10min以洗脱特异结合的噬菌体，2mol／L Tris-HCl(pH9.1)中和后，取2μl噬菌体接种大肠杆菌XL1-Blue菌进行空斑滴定，其余噬菌体扩增后用于下一轮筛选，共重复3轮淘洗。空斑滴定显示淘洗过程中有明显的富集趋势。山西医科大学硕士学位论文第三次淘洗的噬菌体感染大肠杆菌XLI一Blue，铺制平板，随机挑取18个分离良好的噬斑，制备噬菌体原种。经双抗体(流感病毒的多抗和辣根过氧化物酶标记M13噬菌体抗体)夹心ELISA鉴定的阳性克隆有12个，分别将其纯化、并进行DNA序列分析。结果12 个阳性噬菌体递呈肤中，有5个氨基酸序列完全相同，并且与流感病毒的PBI、PA、Nsl蛋白有同源性，另2个氨基酸序列相同，其余的5个氨基酸序列之间也有一定的相似性。提示阳性噬菌体递呈肤可能为流感病毒的模拟表位。并且在这12个阳性克隆中，有8个可特异性的与HINI多抗结合，可能为二者共有的抗原表位口 2.模拟表位的免疫保护作用分析根据模拟表位的序列相似性分3组免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，10只/组，以野生噬菌体为阴性对照。将阳性的噬菌体克隆大量扩增、并测定蛋白浓度后，以100协留只的剂量皮下注射BALB/c小鼠，间隔两周加强免疫，加强免疫剂量为30林留只，共免疫3次。每次免疫后尾部采血，检测血清中的流感病毒特异抗体和抗体中的 IgGI/IgGZa比值，以确定免疫反应的主要类型(ThZ/Thl)。二次免疫后4组的血清抗体阳性率分别为72.7%、25.0%、33.3%和O%;三次免疫后4组的血清抗体阳性率分别为90.9%、88.9%、85.7%和O%。提示筛选出的表位可诱导特异性抗体产生。而血清中针对流感病毒的 IgGZa含量明显高于IgGI，初步推断模拟表位引起的免疫反应是以Thl 引起的细胞免疫为主。用9日龄鸡胚培养人流感病毒的鼠肺适应株户JP侧8/34(HINI)，通过血凝实验测得病毒滴度为1:320。以10一仪10一，八个稀释度的病毒鼻腔接种小鼠，0.lml/只，测定其小鼠半数致死量(LDS。)，结果为山西医科大学硕士学位论文 10一“25。第三次免疫两周后，以sxLDS。的A/p侧8/34(HINI)经鼻腔攻毒小鼠，观察免疫噬菌体接种的保护作用，14d后四个组的生存率分别为:40%、20%、40%和。%，而且免疫组小鼠死亡时间较对照组明显推后。结果显示筛选的模拟表位有部分交叉保护作用。通过以上实验，筛选到具交叉免疫保护作用的甲型流感病毒模拟表位，为流感疫苗的研制提供了新的思路和有益的线索。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R373
【部分图文】：

结构图,甲型流感病毒,结构图

段负链RNA病毒川，分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒的危害最为严重。其形状常为球状，直径约80一120nm，丝状体长可达数微米。其结构分三层(见图1)，由外到内分别为:双层类脂囊膜、球型蛋白壳和核壳体。囊膜来自病毒感染的宿主细胞，囊膜上散布着三种形态不同的蛋白突起:一种象三角形细长棒的称为血凝素(HA)，另一种象蘑菇状的称为神经氨酸酶(NA)，HA与NA在囊膜的比例为4:1，较小的一种叫MZ;中间层是类脂膜下面的基质蛋白(MI)形成一个或若干个分子厚的球型蛋白壳;里层即裹在蛋白壳内的核壳体，直径9一15nm，包含核壳(即)、三种多聚酶蛋白(PBZ、pBI、PA)和病毒基因组RNA。RN只R卜‘气g附nome十N户O闪52图1甲型流感病毒结构图

【参考文献】