体外培养嗅鞘细胞的NT-3基因修饰

发布时间：2020-10-02 10:13

　　 目的：脊髓损伤是常见疾患，造成许多病人肢体功能的障碍。嗅鞘细胞(OECs)兼有雪旺氏细胞与星形胶质细胞的双重功能特点，它能伴从PNS进入CNS而不同于雪旺氏细胞仅局限于PNS中，克服雪旺氏细胞与成纤维细胞在脊髓移植中功能的不足；嗅鞘细胞能在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘，保护其不受局部抑制因子的影响；嗅鞘细胞尚可分泌多种神经生长因子。OECs移植治疗脊髓损伤的具有良好的前景。但由于OECs本身表达神经营养因子的水平较低，尚不能满足轴突再生的需要，实验中在损伤稍远处观察到再生轴突的数量仍较少。NT-3是NTs家族众多的成员中最有效的一种，其对轴突再生的促进效果优于NGF和BDNF。但由于外源性神经营养因子不能通过血脑屏障，半衰期短，临床应用上尚缺乏安全有效的给药途径。本研究的目的是利用基因工程技术从大鼠基因组中扩增出NT-3基因，构建出真核表达载体，并将其转入OECs中，探讨其在OECs中的表达，有望使其更好地发挥其促进再生的能力。 方法：从大鼠肝细胞中提取出大鼠基因组DNA，通过PCR方法进行NT-3的基因扩增，进行酶切后插入真核表达载体PcDNA3.1(+)，经基因序列分析，筛选正确的克隆，应用脂质体介导的方法将其导入体外培养的嗅鞘细胞，采用RT-PCR、Westem blot、ELISA等方法进行转染后的检测。最后，将转染后的嗅鞘细胞培养上清加入神经母细胞瘤细胞培养基进行培养，观察分泌蛋白的生物学活性。 结果：采用二次PCR的方法从基因组中扩增出了NT-3全长cdS， 军医进修学院硕士毕业论文 酶切后插入真核表达载体PcDNA3.1(+)，重组克隆经酶切鉴定正确， 序列测定结果与文献报道一致。转染OECs后可检测到NT3mRNA的表 达量的增加，OECs细胞裂解液应用Western Blot方法培养、上清采 用E L 1 SA方法可检测到NT一3蛋白的表达，同时，此上清对神经母细 胞瘤细胞的存活与突起生长具促进作用。 结论:由于OECs相对于雪旺氏细胞与成纤维细胞的诸多潜在优 势，是脊髓损伤基因治疗较好的受体细胞。重组PcDNA3.1(+)一NT3 载体可对体外培养的嗅鞘细月色进行转染，可增加NT一3蛋白表达分泌 量，且分泌的NT--3蛋白具生物学活性，为基因币封乍嗅鞘细胞在脊髓 损伤治疗的应用提供了实验和理论依据。
【学位单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【文章目录】：
1 缩写词
2 中文摘要
3 英文摘要
4 前言
5 实验部分
    5.1 大鼠NT-3基因真核表达载体的构建
    材料和方法
        结果
        讨论
参考文献
    5.2 NT-3基因转染嗅鞘细胞与表达检测
        材料和方法
        结果
        讨论
    参考文献
6 小结
7 论文照片
8 文献综述
9 参考文献
10 致谢

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 周海胜,夏劲松,陈治文,夏俊,刘贤锡;TRAIL胞膜外段融合蛋白在大肠埃希菌内可溶性表达[J];蚌埠医学院学报;2003年02期

2 王琦,李伟鹏,黄仲曦;人类肿瘤特异性启动子计算机识别方法研究[J];北京生物医学工程;2005年02期

3 李良志,杨家翔;肾病综合征高脂血症与动脉粥样硬化临床观察[J];重庆医学;2001年03期

4 陈素玲,赵美蓉,王明保;PCR-SSCP银染法检测结核分枝杆菌rpsL基因突变[J];中国医师杂志;2001年01期

5 张莉莉,张苓花,史剑斐,王运吉;利用氯化苄提取真菌基因组DNA及其分子生物学分析[J];大连轻工业学院学报;2000年01期

6 黄文,朱佩芳,王正国;人类疾病相关基因定位研究的策略和方法[J];第三军医大学学报;2003年04期

7 向前,俞守义,王红;对喹诺酮类药物耐药的志贺菌gyrA基因突变的研究[J];第一军医大学学报;2001年12期

8 张捚歆,申洪;肺增生病变FHIT基因微卫星不稳定和杂合性丢失的研究[J];第一军医大学学报;2003年04期

9 陈学清,王亚东,孙勇,段佑才,马高峰;体外拼装凋亡素基因[J];第一军医大学学报;2005年02期

10 许红民,王强,白雪娟,钟定荣,曹秀堂,张金萍,丁彦青,姚开泰;利用全基因组寡核苷酸筛选大肠癌差异表达基因[J];第一军医大学学报;2005年09期

相关博士学位论文 前10条

1 王文宏;联合基因转移FasL、P21～(WAF1/CIP1)治疗人脑胶质瘤的实验研究[D];苏州大学;2001年

2 郭君其;晚期糖基化终产物修饰的β_2微球蛋白对人关节滑膜细胞病理生物学作用的研究[D];第一军医大学;2001年

3 孙倍成;FasL逆转录病毒体系的构建及诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D];南京医科大学;2001年

4 常富业;脑宁康防治中风病先兆证的研究及对脑缺血预适应相关因素的影响[D];山东中医药大学;2001年

5 姚华;砷作用的远期效应及其分子遗传机制的研究[D];新疆医科大学;2001年

6 薛桥;D-半乳糖预处理鼠肺感染时心功能的改变及机制[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年

7 杨少波;人胃腺癌相关基因谱研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年

8 张安平;汉族人寻常型银屑病与HLA基因分型的实验研究[D];南京医科大学;2002年

9 吴静;肝细胞核因子（-1β,-4α,-1α）与2型糖尿病关系的研究[D];重庆医科大学;2002年

10 陈军;人Fas Ligand cDNA的克隆、表达对HepC_2细胞系细胞凋亡影响[D];中南大学;2003年

相关硕士学位论文 前10条

1 李民;人脑胶质瘤中HOXD10基因表达与临床意义的研究[D];南京医科大学;2011年

2 李战伟;人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用研究[D];西北农林科技大学;2011年

3 姜岭梅;TTV感染病人肝组织中的TTVDNA的定位与分布研究[D];暨南大学;2000年

4 常小飞;机械力刺激下大鼠脑微血管内皮细胞的信号转导途径的研究[D];北京工业大学;2000年

5 杨中汉;高脂血症患者脂蛋白脂酶基因异常的初步研究[D];暨南大学;2001年

6 张华;妊娠高血压综合征时胰岛素抵抗分子机理的初步研究[D];第二军医大学;2001年

7 罗晨玲;肺癌患及其家庭成员P53异常和GSTM1基因型的流行病学研究[D];第一军医大学;2001年

8 李亮;不同地方乌骨鸡种群遗传多样性的微卫星分析[D];四川农业大学;2001年

9 李彩霞;流动剪切力对培养人脐静脉内皮细胞原癌基因c-fos和c-myc蛋白表达的影响[D];北京工业大学;2001年

10 程佶;新生鼠缺氧缺血性脑损伤神经元型一氧化氮合酶基因表达的研究[D];天津医科大学;2002年

本文编号：2832275