利用泛素结合结构域UBAN探针鉴定线性泛素化底物

发布时间：2020-10-23 05:08

　　 目的根据已知线性泛素化底物NF-κB必需调节蛋白(NEMO)的泛素结合结构域UBAN构建蛋白探针,在目的细胞中富集线性泛素化底物并应用质谱技术进行鉴定,探索线性泛素化在不同生物学事件中发挥调控功能的分子机制。方法 (1)首先通过大肠杆菌表达系统表达纯化特异性识别线性泛素链的蛋白UBAN,通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签将其与GST琼脂糖微珠连接制成UBAN探针。随后在293T细胞中共转染阳性底物NEMO和线性泛素化链组装复合体(LUBAC)使之过表达,利用UBAN探针免疫共沉淀富集NEMO上的线性泛素链,并通过Western蛋白印迹法验证UBAN探针与线性泛素化链的结合能力,从而确定体系是否建立成功。(2)在293T细胞裂解液中免疫共沉淀富集线性泛素化底物并对其进行质谱鉴定和生物信息学分析,得到潜在线性泛素化底物。在293T细胞中共转染潜在线性泛素化底物极光激酶A(Aurora-A)和LUBAC,用Western蛋白印迹法鉴定。(3)用siRNA干扰Hela细胞LUBAC,并使细胞周期同步化,用Western蛋白印迹法观察线性泛素化对潜在底物Aurora-A生物学功能的调控。结果 (1) Western蛋白印迹法结果表明,UBAN探针能够结合NEMO上的线性泛素链,从而确定体系建立成功。(2)质谱鉴定结果显示,免疫共沉淀法富集到包括极光激酶A(Aurora-A)在内的403个潜在线性泛素化底物;在293T细胞中共转染Aurora-A和LUBAC后,用Western蛋白印迹法测定结果发现,Aurora-A具有线性泛素链特征性条带,具有与线性泛素化链结合的能力。(3) Western蛋白印迹实验结果显示,与对照组相比,干涉LUBAC后Aurora-A苏氨酸288位磷酸化水平上调,表明其被激活。结论运用泛素结合结构域UBAN探针可以实现线性泛素化底物的有效捕捉与富集,在293T细胞中鉴定到底物Aurora-A的自激活可能受线性泛素化调控。本研究建立的线性泛素化底物鉴定策略为进一步探索蛋白质线性泛素化修饰的更多生物学功能提供了新的思路和方法。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞、试剂和仪器
    1.2 M1-SUB探针制备
    1.3 M1-SUB探针中GST-UBAN蛋白含量测定
    1.4 M1-SUB探针功能验证
    1.5 用M1-SUB探针免疫共沉淀富集线性泛素化底物
    1.6 蛋白质质谱鉴定潜在线性泛素化底物
    1.7 潜在线性泛素化底物生物功能分析
    1.8 Western蛋白印迹法验证Aurora-A与线性泛素链结合活性
    1.9 Western蛋白印迹法检测Aurora-A功能
2 结果
    2.1 M1-SUB探针中GST-UBAN蛋白的含量
    2.2 M1-SUB域探针与线性泛素链的结合能力
    2.3 用M1-SUB探针富集的潜在线性泛素化底物及其生物功能
    2.4 潜在底物Aurora-A与线性泛素链的结合活性
    2.5 线性泛素化对Aurora-A功能的影响
3 讨论

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本文编号：2852594