应用多重PCR方法对东北地区dystrophin基因缺失分布的研究及其应用

发布时间：2020-10-23 06:43

　　 前言 杜氏／贝克型肌营养不良症(Duchenne/Becker Muscular Dystrophy)是一种人类常见的致死性神经一肌肉系统的X连锁隐性遗传病，二者是dystrophin基因等位基因异质性疾病，发病率分别为活产男婴的1／3500和1／30000。其中DMD是肌营养不良症中最严重和最常见的类型，发病早(约3岁左右)，进展快；Gowers征阳性，下肢病变早于上肢，对称性发展；腓肠肌、股四头肌、三角肌呈假性肥大，伴有关节挛缩、脊柱畸形；血清肌酸磷酸激酶(CPK)明显升高；肌活检显示营养不良性肌病型，预后极差，患者多于20岁左右因呼吸衰竭、心力衰竭或呼吸道感染而死亡。BMD为DMD的等位良性型，发病较晚(5～20岁)，病情相对较轻，进展缓慢，预后也较差，患者多于40岁左右死于呼吸衰竭或呼吸道感染。 Dystrophin基因定位于Xp21.1～21.3，全长约为2400kb，是目前已知的人类最大的基因，占整个X染色体长度的1％及整个基因组长度的0.1％，其中78个内含子为该基因的大部分序列，其79个外显子编码序列总长度仅为14kb。Dystrophin基因突变以缺失最为常见，约占55～65％，重复约占5～10％，1／3左右为新生突变。据文献报道98％的缺失断裂点发生在内含子区域，缺失断裂点的分布是非随机的，内含子序列在不同地域及民族中存在显著性差异。近年来，Chambedain等及Beggs等在两个缺失热点区共设计了18对引物，建立了检测本病基因缺失的多重PCR体系，使DMD／BMD的基因诊断方法更简便准确，其优越性已大大超过Southern印迹分析。Dystrophin基因缺失的分布特点随地域及民族的差异而有不同特点。我们应用12对外引物的多重PCR法对我国东北地区120例DMD／BMD患者进行缺失筛查，了解缺失型 患者dystrophin基因缺失的断裂点分布，同时排除内含子长度的 影响因素后分析中央缺失热区各内含子的不稳定性及对各引物进 行优化组合，并且为29例DMD／BMD高危孕妇开展了遗传咨询和 产前基因诊断工作。 实验材料与方法 临床诊断为DMD／BMD的来自东北地区共120例男性患者， 其中BMD 18例均为散发，在102例DMD患者中22例有家族史。 30例对照者均为正常人。每名受检者采外周静脉血 1－SInl；29 名DMD／BMD先证者的母亲（其中5名有家族史）再次妊娠时要 求作产前基因诊断，于孕早期k5－60天）抽取胎儿绒毛或孕中期 门一20周）抽取革水。 提取外周静脉血DNA，用多重PCR法检测患者缺失分布；对 查出缺失的患者用PCR检测断裂点分布。从胎儿绒毛或羊水中 提取胎儿DNA后，先用PCR扩增判断胎儿性别，再行多重PCR扩 增检测男性胎儿是否缺失。若胎儿为女性或男性胎儿未查出有外 显子缺失，则行STR单体型连锁分析（详见另文人 实验结果 120例患者中检出至少有二个外显子缺失者为59例门例有 家族史人检出率为49．2％，其中40例K7．8％）分布于外显子 45－53，13例（22％）分布于外显子8－19，5例（8．5％）在这两个 热区内均有外显子缺失，仅有 1例一．7％）检出外显子 34和 43缺 失。59例缺失型患者中，断裂点位于内含子44－52内占66．4％ ，以内含子 50为最多（占 14．8％），内含子 44j 次之（分别为 11．7％在．6％人大多数K4．7％）的断裂点位于内含子 o－52 内。两对外显子引物的优化组合为48和8，总检出率为30．8％， 占12对引物检出率的62．6％。29例高危胎儿中男性16例K例 ·2· 有家族史人其中9例被检出为缺失型O例有家族史厂缺失位点 与先证者相同。 结 论 首次对东北地区120例DMD瓜MD患者用12对引物进行多 重PCR方法缺失筛查，缺失检出率为49．2％，缺失主要分布于两 个热区内：外显子8－19p2呢）及外显子45－53K7．8阮X并且 外显子8附近区域可能是东北地区 dystrophin基因缺失断裂的高 发区。 东北地区人群dystroPhin基因内含子44J2高度不稳定，其 中内含子44的稳定性要高于中央缺失热区分子结构的稳定性， 内含子50的不稳定性存在地区及种族差异。 本研究所统计的外显子引物优化组合为检测患者或进行产前 基因诊断时提供了捷径，我们应用多重PCR方法对DMD／BMD高 危男性胎儿进行产前基因诊断，尤其是对散发家系是可行的并且 有其优越性。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R394
【部分图文】：

为第2组外显子51、12、50、53引物多重PCR电泳条带
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本文编号：2852683