类鼻疽伯克霍尔德菌bopA基因敲除株的构建及生物学特征

发布时间：2020-10-29 06:50

　　 【【背景】类鼻疽杆菌是一种能够引起人类疾病甚至死亡的胞内寄生菌,Ⅲ型分泌系统在该菌入侵上皮细胞、逃避宿主免疫以及毒力因子的分泌过程中发挥重要作用,其中bopA基因为TTSS-3基因编码的重要效应蛋白,在类鼻疽杆菌的免疫逃逸中发挥重要作用。【目的】构建类鼻疽杆菌bopA基因敲除菌株,并对其生物学特征进行初步研究。【方法】构建pK18mobSacB-ΔbopA自杀质粒,通过大肠杆菌S17-1λpair以接合的方式转入类鼻疽杆菌,利用同源重组敲除了bopA基因,并用蔗糖平板筛选出菌株,最后在细胞和动物水平检测敲除菌株的表型变化。【结果】构建了bopA敲除的类鼻疽菌株,并通过细胞和动物实验证实敲除bopA基因后,细菌的细胞侵袭和胞内存活以及体内定殖能力都显著降低。【结论】利用同源重组成功构建类鼻疽bopA基因敲除株,为深入研究该基因的作用靶点奠定了实验基础。
【部分图文】：

trol.2.3敲除菌株与野生株生长曲线以实验室野毒株BPC006为对照，可见BPC006与BP(ΔbopA)菌株生长情况相似，均在12h达到对数生长期，而24h后进入生长平台期(图5)。说明bopA基因敲除不影响BP细菌本身的生长活力。2.4bopA基因缺失对类鼻疽杆菌的细胞黏附率和侵袭率的影响作为类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统的重要分子，bopA基因在细菌致病过程中发挥着重要作用。为了验证bopA基因敲除对细菌活力的影响，利用小鼠巨噬细胞RAW264.7进行了细菌的黏附和侵图5bopA敲除菌与野生菌的生长曲线Figure5GrowthcurvesofbopAknockoutstrainandwild-typestrain

74.45%和0.12%。结果表明敲除bopA基因后，BP细菌黏附性增加，而进入细胞的能力明显降低。2.5bopA基因缺失对类鼻疽杆菌胞内存活的影响类鼻疽杆菌可以侵入多种吞噬和非吞噬细胞，并在细胞内进行增殖，发挥其细胞毒性，其在胞内的存活情况与其抵抗细胞清除能力密切相关。通过胞内存活实验结果(图6)可以看出bopA缺失株侵袭率明显低于WT(结果同上)，感染初期细菌存活量减少，可能是感染早期激活了细胞自噬，4h后BPC006野生株在胞内快速增殖，而敲除株在胞内图6bopA敲除菌与野生菌胞内存活和增殖情况Figure6IntracellularsurvivalandproliferationofbopAknockoutstrainandwild-typestrain增殖缓慢甚至无法增殖，说明bopA基因在类鼻疽杆菌的免疫逃逸中具有重要的作用。2.6bopA基因缺失对类鼻疽杆菌感染后细胞形态影响类鼻疽杆菌主要是通过抑制LC3介导的吞噬作用，从吞噬体逃逸到细胞胞质，一旦细菌进入胞质，就会激活BimA介导的肌动蛋白运动活性、大量繁殖并侵入邻近细胞形成肌动蛋白尾和多核巨细胞(Multinucleargiantcell，MNGC)。由实验结果(图7)可以看出野生株感染4h后细胞形成肌动蛋白尾，而感染8h后大量细菌从细胞中逃逸出来，导致细胞肌动蛋白尾数量增多，并形成MNGC，而bopA敲除的菌株则没有发生明显的变化，且胞内细菌数量少。2.7bopA基因缺失对类鼻疽杆菌的小鼠肝脏、脾脏以及肺载菌量的影响对分别腹腔注射BPC006和BP(ΔbopA)小鼠进行观察，注射BPC006的小鼠在第3天出现毛皮蓬乱、精神萎靡现象，而感染BP(ΔbopA)细菌的小鼠则未出现明显的症状。通过小鼠肝脏、脾脏以及肺

卢晓雪等:类鼻疽伯克霍尔德菌bopA基因敲除株的构建及生物学特征241Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn图7细菌感染后细胞共聚焦图片Figure7ConfocalmicrographswithDICimagesofRAW264.7cellsinfectedwithbopAknockoutstrainandwild-typestrain注：绿色：细胞骨架；蓝色：细胞核；红色：类鼻疽杆菌；白色箭头：肌动蛋白尾；红色箭头：MNGC.Note:Green:F-actin;Blue:Nucleus;Red:BP;Whitearrow:Actintails;Redarrow:MNGC.自噬水平的重要标志，而SQSTM1蛋白则是检测自噬流是否通畅的重要标志。一般情况下，自噬激活，MAP1LC3B表达量增加，同时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，自噬体与溶酶体融合，SQSTM1随之被降解；反之则SQSTM1积蓄。已有研究表明，类鼻疽杆菌能够图8小鼠不同脏器载菌量Figure8BacterialcountofbopAknockoutstrainandwild-typestrainindiffentorgansofmiceNote:*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001.影响自噬体与溶酶体融合过程[9]，为了研究bopA基因缺失对类鼻疽杆菌感染后细胞自噬的影响，检测了不同菌株感染后自噬相关蛋白的表达情况(图9)。结果显示BPC006和BP(ΔbopA)都能够激活自噬(MAP1LC3B-Ⅱ明显增加)，但不同于BPC006能够通过抑制自噬流逃逸宿主免疫，BP(ΔbopA)感染后细胞SQSTM1蛋白明显减少，自噬流通畅，与Rapa激活细胞自噬结果相同。图9bopA敲除对BP感染后细胞自噬相关蛋白表达的影响Figure9EffectofBPbopAgeneonautophagyrelatedproteinexpression
【参考文献】

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本文编号：2860542