单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因组测序及比较基因组学分析

发布时间：2017-04-05 01:19

  本文关键词：单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因组测序及比较基因组学分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)为兼性胞内寄生的革兰阳性菌,能够感染人类并引发胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等临床症状,死亡率高达20%-30%,同时也能感染40多种动物,其中反刍动物为易感宿主,感染后死亡率为20%-100%,因此,LM是一种重要的食源性人兽共患病原菌。食品污染导致的李斯特菌病暴发疫情在欧美国家时有发生,在美国是引发食物中毒致死的第三大“元凶”。然而,对这些引起李斯特菌病暴发或散发菌株的内在联系及差异本质认识不足或知之甚少,而不断发展的全基因组测序技术能够更全面、精细地分析基因组的碱基序列,对于解读其所包含的遗传信息和揭示LM的致病机制提供了强有力的技术支持。在后基因组时代,可以通过比较基因组学分析的方法来诠释这些生物学特征的遗传信息。因此,本研究分别对我国两株高毒力羊临床LM分离株XYSN与NTSN进行了全基因组测序和注释分析,并利用生物信息学软件进行比较基因组学分析,从而对基因组的遗传结构、毒力相关因子和系统发育进化有了更为全面深入的理解。在此基础之上,通过同源重组技术对XYSN中的基因组岛9(genomic island 9,G19)进行敲除,并探究其与XYSN高致病力之间的联系。这些研究结果为LM的致病机制及李斯特菌病的预防和控制提供了更可靠的科学依据和理论基础。1.动物源分离株XYSN和NTSN的生物学特性研究对动物源分离株XYSN和NTSN进行了生物学特性的相关研究。传统生化反应管结果显示XYSN不确定,而全自动微生物生化鉴定系统结果为单核细胞增生李斯特菌,而NTSN生化鉴定结果均为单核细胞增生李斯特菌。借助多重PCR及LM诊断血清对分离株的血清型进行鉴定结果显示,XYSN血清型尚不明确(4b或4e),而NTSN血清型为4b。药敏实验结果提示,XYSN和NTSN对多种抗生素均表现敏感。对Caco-2细胞侵袭试验结果表明,XYSN和NTSN侵袭Caco-2细胞的侵袭率分别为11.5%和6.35%,分别比国际标准株EGD-e(侵袭率为1.53%)高8倍和4倍,表明其具有较高的侵袭力。对BALB/c小鼠的LDso实验测定中,XYSN的LD50为103.10CFU,毒力比强毒株EGD-e强400倍,为迄今为止发现毒力最强的LM分离株,而NTSN的LD50为1055.46CFU,毒力与EGD-e相当,属于强毒菌株。此外,基于管家基因的MLST分型结果显示,XYSN和NTSN的ST型分别为626和1,其中STl属于克隆复合群(Clonal Complex, CC) CC1,而ST626为新申请的ST型。而基于毒力基因actA的遗传谱系进化分析结果表明,XYSN位于谱系Ⅰ和Ⅱ之间,但与谱系Ⅱ的菌株亲缘关系更近一些,表明其进化过程的特殊性。而NTSN为典型谱系Ⅰ菌株,其与造成人李斯特菌病暴发的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)处于同一进化位置,暗示其可能属于高侵袭性流行克隆。2.单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN的全基因组测定及注释分析单核细胞增生李斯特菌XYSN是迄今发现的毒力最高的山羊临床分离株。通过Roche454和Sanger法测序技术,完成了XYSN的全基因组测序和补缺口(Gap closing)工作。全基因组注释分析结果显示,XYSN基因组全长2,994,702 bp, GC含量为37.95%,编码2933个蛋白预测基因,编码区占整个基因组的88.3%,蛋白平均长度为300个氨基酸,含有67个tRNA以及18个rRNA (16S、23S和5S rRNA各6个)。在基因组和基因注释的基础上,运用生物信息学软件和数据库预测分析出1个CPRISPR、9个基因组岛、5个前噬菌体、14对双组份调控元件以及一个单独的调节蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型限制修饰系统中相关基因以及19个内化素。与其他LM菌株相比,XYSN的内化素数量差异较大,存在inlD、 inlK、inlE、inlF和inlI等内化素基因缺失,也存在5个特异的内化素基因,其中i-inlF、 i-inlE和LMxysn_2611均来自伊氏李斯特菌,i-inlF和i-inlE存在于基因组岛9中,而LMxysn_2611存在于前噬菌体5中。单核细胞增生李斯特菌NTSN是具有强毒力和潜在暴发流行特点的绵羊临床分离株。与XYSN采用的测序方法一样,我们完成了NTSN全基因组序列的测定。全基因组注释分析结果显示,NTSN基因组全长2,904,500 bp, GC含量为38.0%,编码2821个蛋白预测基因,编码区占整个基因组的88.9%,蛋白平均长度为304个氨基酸,含有67个tRNA以及18个rRNA (16S、23S和5S rRNA各6个)。NTSN基因组中含有1个基因组岛、1个前噬菌体、14对双组份调控元件以及一个单独的调节蛋白、Ⅱ型限制修饰系统中相关基因和26个内化素。其中,NTSN中内化素的组成和分布与谱系Ⅰ的4b血清型LM菌株极其相似。3.单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比较基因组学分析和进化分析在XYSN比较基因组学分析中,首先选择国际标准株EGD-e和F2365作为参考菌株,基因组共线性分析显示XYSN与EGD-e和F2365之间基因组的共线性很好,只有2个共线性模块(Locally colinear blocks, LCBs)。基因组间并未存在翻转、易位等基因组重排现象,但存在缺失或插入,这与氨基酸水平的比对分值比(BLAST score ratio, BSR)分析结果一致。此外,选取测序菌株XYSN在内的15个LM菌株的全基因组,进行LM泛基因组构建与分析结果表明,LM作为一种较保守且稳定的物种,具有开放型的泛基因组,能够容纳较低程度的水平基因转移。综合比较BSR分析和泛基因组分析结果显示,XYSN基因组中的特异基因主要为假定蛋白以及一些编码转座酶和整合酶的基因,其中部分基因存在于5个前噬菌体和9个基因组岛中。对XYSN进行潜在毒力基因分析,共挖掘出102个潜在毒力相关基因,并系统深入地总结了LM不同功能分类的毒力相关基因。此外,毒力相关基因比较分析显示,XYSN基因组中存在毒力基因缺失、其他属特有毒力基因获得以及共有毒力基因突变的现象,暗示这些差异可能与其高致病力相关。同时,基因突变、缺失和水平基因转移可推动XYSN进化过程。在NTSN比较基因组学分析中,选择谱系Ⅰ、4b血清型的标准株F2365与LL195作为参考菌株,基因组共线性结果显示,NTSN与F2365和LL195之间基因组的共线性极高,仅有1个LCBs,说明基因组序列非常地保守。进一步分析表明,NTSN与F2365高度同源,同源性为99.9%,提示其具有相似的流行特征,但仍含有195个SNPs以及34处插入和缺失,暗示这些因素可能造成生物学特征的微小差异。在进化分析中,基于MVLST分型毒力基因、MLST分型管家基因和基于全基因组中818个核心同源基因的进化分析结果均显示,XYSN处于两大进化分支谱系Ⅰ和Ⅱ之间,但与谱系Ⅱ的菌株亲缘关系较近,表明其进化过程的特殊性。而NTSN属于典型的谱系Ⅰ菌株,其与造成人李斯特菌病暴发的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)处于同一进化位置,显示它们是由同一祖先进化而来,且NTSN亦具有引起人李斯特菌病暴发的潜在可能。4.单核细胞增生李斯特菌XYSN中基因组岛9缺失突变株的构建、鉴定及生物学特性研究利用同源重组技术成功构建了单核细胞增生李斯特菌XYSN中GI9的缺失突变株。利用PCR扩增出XYSN基因组中GI9的上下游同源臂片段之后,采用SOEing PCR方法将上下游同源臂拼接起来,并将拼接片段与pMD20-T载体相连后测序鉴定。测序正确的质粒经双酶切回收后插入载体pAULA中,获得的重组质粒经电转化导入XYSN感受态细胞中。在温度和红霉素抗性双重选择压力下传16代后发生同源重组,然后将质粒脱去PCR测序鉴定后,最终获得GI9缺失的菌株XYSNAGI9。在获得缺失突变株XYSNΔGI9基础上,我们对GI9的生物学特性进行了探究。缺失突变株与其亲本株的生长曲线、生理生化特性和对药物的敏感性均无显著差异,表明GI9对生长代谢的影响作用不明显。卵磷脂酶实验中XYSN和XYSNΔGI9菌落周围均出现透明圈,说明缺失突变株的磷脂酶活性并未受影响。溶血试验中XYSN的溶血效价为25,XYSNAGI9的溶血效价为24,缺失突变株溶血能力减弱了2倍,表明GI9与XYSN的溶血特性有关。而对BALB/c小鼠的LDso实验结果表明,缺失突变株的毒力较亲本株下降8倍,缺失突变株的毒力有了显著降低,表明GI9与XYSN的致病性相关,是XYSN基因组中除了prfA基因簇和inlAB外一新的毒力岛。
【关键词】：单核细胞增生李斯特菌 全基因组序列 比较基因组学 毒力相关基因 遗传进化 缺失突变株 基因组岛9 生物学特性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378;Q78
【目录】：

• 中文摘要2-6
• Abstract6-13
• 符号说明13-15
• 文献综述15-32
• 1 单核细胞增生李斯特菌研究进展15-23
• 1.1 李斯特菌属概述15
• 1.2 致病性李斯特菌主要毒力相关因子15-23
• 2 微生物基因组学研究进展23-27
• 2.1 DNA测序技术进展23-24
• 2.2 微生物基因组学研究的应用24-27
• 2.3 小结27
• 参考文献27-32
• 第一章 动物源分离株XYSN和NTSN的生物学特性研究32-41
• 1 材料和方法32-34
• 1.1 材料32-33
• 1.2 方法33-34
• 2 结果与分析34-38
• 2.1 生化试验34-35
• 2.2 血清型鉴定35
• 2.3 药敏试验35-36
• 2.4 细胞侵袭实验36-37
• 2.5 BALB/c小鼠的LD_(50)测定37
• 2.6 MLST分型37
• 2.7 基于actA基因的遗传谱系分析37-38
• 3 讨论38-40
• 参考文献40-41
• 第二章 单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因组序列的测定与注释分析41-70
• 1 材料和方法41-45
• 1.1 材料41-42
• 1.2 实验方法42-45
• 2 结果与分析45-65
• 2.1 基因组DNA的提取45-46
• 2.2 基因组测序的基本信息46
• 2.3 LM XYSN和NTSN基因组测序的注释及分析46-65
• 3 讨论65-68
• 参考文献68-70
• 第三章 单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比较基因组学分析和进化分析70-108
• 1 材料和方法70-75
• 1.1 材料70-73
• 1.2 实验方法73-75
• 2 结果与分析75-103
• 2.1 基因组共线性分析75-78
• 2.2 BSR分析78
• 2.3 同源基因聚类比较分析78-79
• 2.4 LM泛基因组构建与分析79-86
• 2.5 XYSN特异基因分析86-87
• 2.6 XYSN毒力相关基因比较分析87-100
• 2.7 进化分析100-103
• 3 讨论103-105
• 参考文献105-108
• 第四章 单核细胞增生李斯特菌XYSN中基因组岛9缺失突变株的构建、鉴定及生物学特性研究108-121
• 1 材料和方法108-111
• 1.1 材料108-109
• 1.2 实验方法109-111
• 2 结果与分析111-116
• 2.1 缺失突变株XYSN△GI9的构建结果111-114
• 2.2 缺失突变株XYSN△G19生物学特性结果114-116
• 3 讨论116-119
• 参考文献119-121
• 全文总结121-122
• 攻读硕士期间发表的学术论文122-123
• 致谢123-124
• 附录124-137

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1 谈卫军;单核细胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因组测序及比较基因组学分析[D];扬州大学;2015年

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本文编号：286242