缺氧对大鼠脑线粒体氧化呼吸功能和ANT活性及异构体表达的影响

发布时间：2020-10-30 16:25

　　 缺氧导致的能量生成不足是中枢神经功能障碍的主要原因,也是急、慢性高原病发生的重要机制,而组织和细胞的能量代谢的改变在机体高原习服与适应过程中起着重要作用。线粒体氧化磷酸化作用提供了机体所需的大部分能量,其结构完整和功能的有效发挥有赖于线粒体膜上一系列参与氧化磷酸化作用的酶及载体。腺苷酸转运体(adenine nucleotide translocator,ANT)是线粒体内膜上的ATP/ADP载体,承担着线粒体内部氧化磷酸化产生的ATP与胞液中ADP的互换转运功能,处于线粒体能量产生与利用的关键位置,其功能活性的正常发挥是线粒体能量合成与细胞正常生命活动的基础。因此探讨缺氧时线粒体能量合成、ANT能量转运及其异构体表达的变化,可以为改善缺氧时线粒体能量生成与利用效率、提高机体对缺氧环境的生存能力提供重要的实验依据。 本研究将健康雄性Wistar大鼠暴露于模拟海拔5000米高原低压舱内,23小时/天,分别连续缺氧1天(H1)、5天(H5)、15天(H15)和30天(H30),同时设立平原对照组。各缺氧组与对照组分别在模拟高原低压舱内和平原断头处死,差速离心分离大鼠脑线粒体,Clark氧电极法测定线粒体呼吸活性,HPLC分析线粒体内腺苷酸含量,抑制剂(CAT)滴定法定量ANT对氧耗速率的控制度以及估计线粒体ANT载体密度,H3-ADP摄入法测定ANT的转运速率,荧光定量RT-PCR检测ANT1、ANT2mRNA表达量,Western blot测定ANT蛋白表达。主要结果和结论如下: 结果 1.与平原对照组相比,缺氧处理的大鼠脑皮质线粒体ST3各组均下降,其中H5、H15、H30组有非常显著的差异;ST4在急性缺氧非常显著升高,随缺氧时间的延长而降低,并在缺氧30天时恢复到对照水平;缺氧后RCR下降,在5天组达到最低水平;缺氧5天、15天、30天后OPR水平非常显著下降。 2. .各缺氧组ANT对最大氧耗速率的流量控制系数(Ci) 与正常组相比均无差异。 WP=8 与对照组比较各缺氧组ANT密度无显著改变;缺氧可显著降低ANT转运活性,各缺氧组与对照组相比均有非常显著差异,其中H5和H15组最低。排除ANT载体密度对其转运活性的影响,计算每pmolANT每分钟可以转运ADP的pmol数,结果显示:缺氧1、5、15、30天组分别降为对照组的11.3%、2.39%、10.86%、28.37%。 3.与对照组相比,缺氧各组ATP显著下降,差异有非常显著意义。缺氧各组线粒体内(ATP+ADP)均比正常对照组降低,且差异有非常显著意义。 5. 与对照组相比,急性缺氧1天大鼠脑ANT1mRNA、ANT2mRNA拷贝数非常显著增加,随缺氧时间延长出现下降又上升的趋势。 6. 各缺氧组与对照组比较ANT蛋白表达均无统计学意义上的差异,缺氧各组之间相互比较也无统计学意义上差异。 结论: 1.缺氧可显著抑制脑线粒体的氧化磷酸化功能,降低电子传递速率和呼吸氧耗,而增加不伴有ATP生成的“无效氧耗”,长期慢性缺氧后“无效氧耗”降低,是缺氧时节约用氧的一种有效方式,提示可能为缺氧适应的机制之一。 2.缺氧暴露后在不改变线粒体内膜上ANT密度的同时,可显著抑制ANT转运活性,从而降低能量产生和利用的周转率,这可能是缺氧时细胞能量代谢障碍的重要机制。 3.ANT对大鼠脑线粒体氧化呼吸过程有较高的控制作用,可占整个呼吸环节的一半以上。缺氧虽可抑制ANT活性,但是并不降低其对氧化磷酸化的控制程度,提示线粒体氧化磷酸化功能障碍与ANT活性降低有关,而与ANT对氧化磷酸化的控制程度无关。 4.缺氧暴露可使脑组织ANT1、ANT2mRNA表达量同时增加,而ANT2增长幅度大于ANT1,提示ANT2在缺氧代偿及缺氧耐受方面较ANT1有更为重要的意义。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R363
【部分图文】：

（p>0.05）；缺氧可显著降低 ANT 转运活性，各缺氧时间组与对照组相比著差异（p<0.01）,其中 H5 和 H15 组最低，与 H1 和 H30 组比较均有显<0.05）；排除 ANT 密度对其转运活性的影响，计算每 pmolANT 每分钟可P 的 pmol 数，结果显示缺氧 1、5、15、30 组分别降为对照组的 11.3％、286％、28.37％。（表二、图 4、5）表二 缺氧对大鼠脑线粒体内 ANT 含量和 ANT 活性的影响( x ± s)Group CiaANT densitya(pmol/mg pro)ANT activity(pmolADP/min/mg pro)turnover numb(pmolADP/ min / pmH0 0.54±0.08 0.59±0.06 9.83±0.69(n=10) 16.67H1 0.45±0.12 0.90±0.35 1.71±0.29**(n=12) 1.90H5 0.59±0.08 0.67±0.15 0.27±0.10**△△(n=12) 0.40H15 0.59±0.06 0.61±0.01 1.10±0.17**△△(n=12) 1.81H30 0.38±0.14 0.56±0.05 2.65±0.27**(n=12) 4.73*: p<0.01 vs H0△△: p<0.01 vs H1:各组数据分别来自 3 批（共 18 只）大鼠独立的线粒体制备液的测量结果。

第三军医大学硕士学位论文起始模板为 108～105copy/ul 的标准品扩增反应的动力学曲t 值越小。标准曲线曲线（见图 12）,获得回归方程 y = -0.25x + 12.28。标准曲，认为拟合效果很好。的荧光定量 PCR 检测结果动力学曲线见图 13。

标准曲线曲线（见图 12）,获得回归方程 y = -0.25x + 12.28。标准曲，认为拟合效果很好。的荧光定量 PCR 检测结果动力学曲线见图 13。图 11 标准模板动力学曲线左到右分别为 108－105copy/ul 的β-actin 质粒的动力学曲线，每一浓度重
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本文编号：2862726