甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1生物学特性及其与宿主相互作用的研究

发布时间：2017-04-05 14:15

  本文关键词：甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1生物学特性及其与宿主相互作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)是导致甲型副伤寒的致病菌,经粪口途径传播；噬菌体是一种细菌病毒,能够侵染并裂解宿主菌。噬菌体普遍存在于宿主菌中,所以在大多数环境下,噬菌体和宿主菌参与持续的联合进化,两者在自然界达到宿主一噬菌体动态平衡。目前对噬菌体与宿主之间相互作用机制尚不清晰,本文筛选了一株甲型副伤寒沙门氏菌烈性噬菌体(LSPA1)、对其生物学特性和基因组学进行分析并研究噬菌体与甲型副伤寒沙门氏菌相互作用,进而更深入认识噬菌体、深层次了解噬菌体与宿主之间的相互作用。目前对于治疗病原菌的感染主要是利用抗生素,然而抗生素的滥用以及生物膜的形成大大降低了抗生素治疗的效果,因此研究一种新型的治疗方法尤为重要。由于噬菌体的宿主特异性和强感染性,对宿主菌而言是个致命的威胁,因此科研工作者设想通过噬菌体治疗达到治愈病原菌感染的效果。为了获得一株新型的噬菌体并深入研究,作者将医院污水和甲型副伤寒沙门氏菌混合培养后,分离纯化甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体；并研究LAPS1部分生物学特性,包括最佳感染复数、pH和温度敏感性、结构蛋白以及初步受体分析。提取LSPA1基因组,用鸟枪法测全基因序列,分析其进化树、同源性和开放阅读框。在研究噬菌体与宿主相互作用中,先利用结合转座筛选抗噬菌体的甲型副伤寒沙门氏菌突变菌,鉴定插入基因,并通过同源重组定点突变和互补实验进一步证明,由于该种基因的突变引起甲型副伤寒沙门氏菌突变菌抗噬菌体的特性；另外发现σ-54依赖的翻译调节器基因与生物膜形成有关联。噬菌体筛选结果表明：1)将医院污水和甲型副伤寒沙门氏菌混合培养,取菌液离心,用上清做双层平板,有透明的噬斑出现,说明了在医院污水中成功筛选出甲型副伤寒沙门氏菌裂解性噬菌体,命名为LSPA1。2)将筛选的噬菌体LSPA1进行浓缩后,电镜观察,噬菌体LSPA1形态呈现64面体的头部,并属于长尾噬菌体。3)提取噬菌体基因组用限制性内切酶酶切,结果表明基因组能酶切,证明噬菌体LSPA1基因组属于双链DNA。噬菌体LSPA1生物特性分析：1)选择不同MOI接种噬菌体,结果表明在MOI为0.2时,能获得最高滴度的噬菌体,证明了0.2为噬菌体LSPA1最佳MOI。2)噬菌体LSPA1一步生长曲线中潜伏期为20 min,爆发期为50 mm,爆发量为129。3)将噬菌体LSPA1进行不同温度和pH处理后,再测量其滴度,噬菌体LSPA1在pH值3～10之间,具有较高的滴度,pH值在1～2和11～12之间,丧失活性；并且随温度上升滴度明显降低,在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在。4)噬菌体LSPA 1进行SDS-PAGE分析,主要包含相对分子质量约67KD、60KD、55KD、40KD四种蛋白,其中55KD为衣壳蛋白。5)实验中初步分析噬菌体的受体为脂多糖和外膜蛋白。噬菌体LSPA1基因组学分析：1)噬菌体LSPA1基因组全长为41880bp,碱基组成：A=25.09%,T=24.43%,G=25.13%,C=25.35%,G+C=50.48%。2)噬菌体LSPA1全基因含有58个ORF,其中38个在正链上,20个在负链上。3)噬菌体LSPA1不仅仅和沙门氏菌噬菌体具有高度亲缘性,同样和大肠杆菌噬菌体也具有很高的亲缘性,其中与SETP3基因组具有高度相似性。4)将噬菌体LSPA1全基因序列提交GenBank,登录号为KM272358.噬菌体LSPA1感染宿主相关基因：1)筛选6株抗噬菌体突变菌,通过测序得知突变基因分别是溶菌酶、假设的蛋白质(可能甲基转移酶)、硫代硫酸盐还原酶电子前体、假定传感器激酶蛋白、乙酰乳酸合酶同工酶III大亚基、假定σ-54依赖的翻译调节器。2)研究发现假定a-54依赖的翻译调节器突变菌生物膜的形态明显发生改变以及成膜能力显著增强。3)通过定点突变和互补实验进一步证明假定a-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜相关基因,且a-54依赖的翻译调节器的缺失宿主表现出抗噬菌体、成膜能力显著增强的特性。本研究中,从医院的污水中筛选一株裂解性甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体,并分析其生物学特性,证明了噬菌体LSPA1属于双链、长尾噬菌体；对噬菌体LSPA1基因基因组学和宿主甲型副伤寒沙门氏菌相互作用分析,证明了其中6种基因与噬菌体LSPA1侵染相关,并且σ-54依赖的翻译调节器的缺失会显著增强甲型副伤寒沙门氏菌的成膜能力。本实验为后续研究噬菌体侵染机制和利用噬菌体治疗病原菌感染奠定基础。
【关键词】：甲型副伤寒沙门氏菌 筛选与分离 基因组学
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略语索引10-11
• 摘要11-13
• ABSTRACT13-16
• 第一章 绪论16-19
• 1.1 噬菌体治疗相关研究16-17
• 1.2 生物膜研究现状17
• 1.3 本文研究背景及其思路17-18
• 1.4 本文研究的目的及意义18-19
• 第二章 甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1的分离与鉴定19-29
• 2.1 材料与方法19-25
• 2.1.1 材料19-21
• 2.1.2 方法21-25
• 2.2 结果25-26
• 2.2.1 甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1的分离25
• 2.2.2 噬菌体LSPA1电镜观察25-26
• 2.2.3 噬菌体LSPA1核酸酶切分析26
• 2.3 讨论26-28
• 2.3.1 噬菌体温和性和裂解性26-27
• 2.3.2 噬菌体的分离27
• 2.3.3 噬菌体生物学特性分析27
• 2.3.4 噬菌体高速密度梯度离心27-28
• 2.3.5 噬菌体形态分类28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 噬菌体LSPA1的生物学特征29-43
• 3.1 材料与方法29-36
• 3.1.1 材料29-32
• 3.1.2 方法32-36
• 3.2 结果36-39
• 3.2.1 最佳感染复数的测定36
• 3.2.2 绘制噬菌体LSPA1一步生长曲线36-37
• 3.2.3 甲型副伤寒沙门氏菌抗噬菌体自然突变率的检测37
• 3.2.4 噬菌体LSPA1 pH及温度敏感性检测37-38
• 3.2.5 噬菌体LSPA1结构蛋白分析38-39
• 3.2.6 噬菌体LSPA1受体初步分析39
• 3.3 讨论39-41
• 3.3.1 噬菌体感染复数40
• 3.3.2 噬菌体一步生长曲线40
• 3.3.3 噬菌体核心蛋白分析40
• 3.3.4 噬菌体自然突变40-41
• 3.3.5 噬菌体侵染41
• 3.3.6 噬菌体特性分析41
• 3.4 小结41-43
• 第四章 噬菌体LSPA1基因组学解析43-60
• 4.1 材料与方法43-50
• 4.1.1 材料43-45
• 4.1.2 方法45-50
• 4.2 结果50-57
• 4.2.1 噬菌体LSPA1基因组碱组成分析50
• 4.2.2 开放阅读框的分析和编码序列的分析50
• 4.2.3 推定基因编码产物多重序列比对分析50-53
• 4.2.4 tRNA编码序列分析53
• 4.2.5 噬菌体LSPA1基因组注释后GenBank提交53-54
• 4.2.6 噬菌体LSPA1相似噬菌体的比较54
• 4.2.7 基因编码产物多重序列比对分析和系统发生树的绘制54-56
• 4.2.8 CoreGene基因组序列分析56-57
• 4.3 讨论57-59
• 4.3.1 鸟枪法测序57
• 4.3.2 生物信息学57-58
• 4.3.3 噬菌体基因组学与基因组注释58
• 4.3.4 噬菌体同源性分析58-59
• 4.4 小结59-60
• 第五章 噬菌体LSPA1感染宿主相关基因60-80
• 5.1 材料与方法60-70
• 5.1.1 材料60-63
• 5.1.2 方法63-70
• 5.2 结果70-76
• 5.2.1 野生型甲型副伤寒沙门氏菌Rif~+抗性的诱导70-71
• 5.2.2 抗噬菌体突变菌筛选71
• 5.2.3 突变菌成膜的观察71-73
• 5.2.4 突变位点的鉴定73
• 5.2.5 定点突变并验证73-75
• 5.2.6 突变菌互补实验75
• 5.2.7 突变菌菌体蛋白表达鉴定75-76
• 5.3 讨论76-78
• 5.3.1 pSC189结合转座76-77
• 5.3.2 转座子插入位点鉴定77
• 5.3.3 抗噬菌体和生物膜突变菌分析77-78
• 5.3.4 突变菌互补分析78
• 5.4 小结78-80
• 全文总结80-82
• 展望82-84
• 致谢84-85
• 参考文献85-90
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录90

【共引文献】

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