nov基因增强OECs促神经再生作用及其差异表达蛋白分离的研究

发布时间：2020-11-06 10:53

　　 与周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)的再生和功能恢复不同,中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后不能再生。长期以来,研究者们试用了多种方法以促进中枢神经系统损伤后的再生,如给予神经生长因子、去除胶质瘢痕、移植干细胞等。此外,基因治疗也是一种广泛应用于促CNS再生的方法,在这一过程中,一些新基因被发现有着很大的应用前景,肾母细胞瘤过度表达基因(Nephroblastoma Overexpression gene,nov)就是其中之一。nov是1991年发现的一种原癌基因,其所编码产物(NOV蛋白)是一种胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)结合蛋白(IGF- binding protein,IGFBPs),属于IGF家族的成员。有资料表明nov基因与动物中枢神经系统的损伤和修复之间存在一定的关系,可能参与CNS损伤后的再生和修复过程。近年,神经科学工作者在CNS损伤方面的研究中对又一种胶质细胞产生了极大的兴趣,这种被称作嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells , OECs)的胶质细胞是介于施万氏细胞和星型胶质细胞之间的一类细胞,在中枢和外周神经内可具有施万细胞类似的细胞内成髓鞘功能,在脊髓损伤和神经退行性病变中可诱导髓鞘生长。从OECs新功能的发现至今,它已经成为把胶质细胞和CNS再生相联系的一个热点,但是以OECs作为受体细胞携带目的基因的研究还少见报道。基因修饰的OECs移植治疗CNS损伤结合了OECs和nov的共同优点,具有研究价值。 为了确定nov对OECs增殖分化的影响以及nov基因工程化OECs对CNS再生和功能修复的影响,把nov基因促进中枢的再生与嗅球成鞘细胞修复脊髓损伤作用结合起来,寻找一种修复中枢神经损伤的新方法,本文就此进行了系列研究.(1) 嗅球成鞘细胞体外取材培养与体外生长特性,细胞增殖,活性研究;(2)NOV质粒扩增、转染和表达,观察NOV对OECs增殖分化的作用;(3)nov基因转染前后OECs的双向电泳分析,寻找差异点,为后期差异蛋白鉴定打基础。希望转染后OECs恒定表达NOV,通过OECs和NOV的共同作用,可能为CNS再生修复提供更适合的微环境。主要结果如下: 1、倒置显微镜下,接种24小时后大部分OECs贴壁呈球状,周围有云状物质分布,培养3天后的OECs呈梭状,主要呈双极,三极,蹼状的生长锥样结构明显,2～14天的细 WP=10 胞纯度可达95%以上,且细胞纯度不随培养时间的延长而明显下降。 2、纯化后培养2天,细胞主要呈双极,三极,细胞走向基本一致,形态近似Schwann细胞,8天时细胞走向基本一致。 3、OECs免疫细胞化学染色及纯度检测:未纯化前培养8天,P75免疫反应细胞胞体较突起着色为深,细胞走向极为不一,纯化后培养2天的细胞几乎均呈阳性,胞膜着色较深,形态呈三角或条梭状,细胞走向不一,背景干净。 4、低温保存过的嗅鞘细胞复苏后生长良好,活性,形态呈梭形,与冻存前一致。活细胞数量达80%以上。 5、对pcDNA3.1-NOV质粒扩增,对获得的cDNA测序,证明获得产物完全符合设计要求。在此基础上成功地将其转染到OECs细胞,用免疫细胞化学技术和 Western-blot方法检测到NOV的表达。 6、与nov修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)有许多DRG细胞向外迁移,细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。未修饰的OECs组只有少量的细胞迁移和突起生长,细胞迁移和突起生长都很局限。空白对照组DRG仅有细胞迁移。 7、利用双向电泳技术分离转染前后OECs表达的差异蛋白,为下一步差异蛋白鉴定提供线索。 综上所述,嗅球成鞘细胞的生长受不同因素影响,细胞纯度不随培养时间的延长而明显下降。nov基因修饰嗅球成鞘细胞表达差异蛋白,为将来质谱鉴定差异蛋白及寻找新的再生因子提供线索。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329
【部分图文】：

图 2-1 pcDNA3.1/Myc-His(+)/LacZ 质粒的结构图 NOVcDNA 序列检测:增的 NOVcDNA 序列和方向是否与报道基因序列一致,采表明,序列与报道的基因序列、方向完全一致。A 全长序列GTACCACA TGAGCGTCTT CCTGCGAAAG CAATGCCTCT GCCTAGGCTCAAGTCTC TGCAACTCTG CGCTGCCCGT CTCGGTGCCC GAGCCAGTGCCCCCGGG GTCCGCTCGG TGCTAGACGG CTGCTCCTGC TGTCCGGTGTTGCTCTG AGATGAGACC CTGCGACCAG AGCAGCGGTC TCTACTGCGGAGACTGG CATTTGCATG GTTCCAGAGG GAGACAACTG TGTGTTCGAAGAAGTTT GAGCCGAACT GTCAATACCA CTGCACCTGC AGAGATGGGCCAGCTGG ATGTGCTTCT GCCAGGTCCT GACTGCCAG CTCCAAAAATGCGAAAA GTGGACCTGT GGCTCAGAGG AGAAGGGGAC ACTGGGAGG

大鼠OECs培养24小时.相差显微镜下X100

大鼠OHCs培养2大，相差显微镜hX200
【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 李成仁,李巍,蔡文琴,苏炳银,陈德英;NOV对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响[J];第三军医大学学报;2003年01期

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本文编号：2873047