基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

发布时间：2020-11-15 09:13

　　 【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。
【部分图文】：

?罚??1.7.1方法进行实时荧光RT-PCR检测，每管重复3次，单因素方差和线性回归方法统计样本的稳定性程度。2结果与分析2.1pET-QGBHAV重组质粒鉴定酶切鉴定重组质粒(图1)幵测序，结果表明重组质粒构建成功，命名为pET-QGBHAV。2.2pET-QGBHAV的诱导表达及纯化pET-QGBHAV在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达，在大约14.1kD处出现一条明显的蛋白条带，如图2所示，与预期结果一致。超声破碎后的上清液经过超离、透析、滤膜过滤、丙烯葡聚糖凝胶层析图1pET-QGBHAV的酶切鉴定图Figure1EnzymedigestionofpET-QGBHAVNote:M:DL15000DNAmarker;1:NotI/BamHI;2:NotI.

姚琳等:基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制213Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn柱纯化后得到AR-HAV，其SDS-PAGE分析结果表明未见其他杂条带，纯化效果良好，如图3所示。2.3AR-HAV的电镜观察甴镜观察纯化后的AR-HAV，可看到大量结构完整、大小均一的病毒样颗粒，直径约25nm，与预期大小一致，结果如图4所示。图2pET-QGBHAV表达产物的SDS-PAGE分析Figure2SDS-PAGEanalysisofpET-QGBHAVexpressproducts注：M：蛋白质分子量；1：未诱导的pET-28a(+)空载体；2：诱导后的pET-28a(+)空载体；3：诱导前重组菌；46：诱导后重组菌.Note:M:Proteinladder;1:pET-28a(+)withoutinduction;2:InducedpET-28a(+);3:Expressproductstherecombinantbacteriawithoutinduction;46:Expressproductsfromtheinducedrecombinantbacteria.图3AR-HAV纯化后SDS-PAGE分析Figure3SDS-PAGEanalysisofAR-HAVafterpurification注：M：蛋白质分子量；12：诱导表达菌液；3：层析纯化AR-HAV.Note:M:Proteinladder;12:Inducedrecombinantbacteria;3:PurifiedAR-HAV.2.4AR-HAV中残留质粒检测以AR-HAV为模板进行实时荧光PCR检测。结果显示AR-HAV与阴性对照的Ct值接近，无明显扩增，说明制备的AR-HAV中无质粒DNA的残留，结果如图5所示。2.5AR-HAV的定值将制备的cRNA进行10倍梯度稀释，采用实时荧光RT-PCR法根据稀释梯度和Ct值绘制出标准曲线：y=3.3471x+40.682，R2=0.999。随机选取15管AR-HAV，采用

25nm，与预期大小一致，结果如图4所示。图2pET-QGBHAV表达产物的SDS-PAGE分析Figure2SDS-PAGEanalysisofpET-QGBHAVexpressproducts注：M：蛋白质分子量；1：未诱导的pET-28a(+)空载体；2：诱导后的pET-28a(+)空载体；3：诱导前重组菌；46：诱导后重组菌.Note:M:Proteinladder;1:pET-28a(+)withoutinduction;2:InducedpET-28a(+);3:Expressproductstherecombinantbacteriawithoutinduction;46:Expressproductsfromtheinducedrecombinantbacteria.图3AR-HAV纯化后SDS-PAGE分析Figure3SDS-PAGEanalysisofAR-HAVafterpurification注：M：蛋白质分子量；12：诱导表达菌液；3：层析纯化AR-HAV.Note:M:Proteinladder;12:Inducedrecombinantbacteria;3:PurifiedAR-HAV.2.4AR-HAV中残留质粒检测以AR-HAV为模板进行实时荧光PCR检测。结果显示AR-HAV与阴性对照的Ct值接近，无明显扩增，说明制备的AR-HAV中无质粒DNA的残留，结果如图5所示。2.5AR-HAV的定值将制备的cRNA进行10倍梯度稀释，采用实时荧光RT-PCR法根据稀释梯度和Ct值绘制出标准曲线：y=3.3471x+40.682，R2=0.999。随机选取15管AR-HAV，采用实时荧光RT-PCR方法测定Ct值，根据建立的标准曲线计算得知AR-HAV拷贝数为2.57×107copies/μL。应用A类不确定度评定方法进行评定，所得AR-HAV的不确定度为0.12×107，因此本次制备的AR-HAV定值结果为(2.57±0.12)×107copies/μL。2.6AR-HAV的均匀性实验均匀性检验结果显示：F=Msamong/Mswithin=1.2
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