细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5’保守区的研究

发布时间：2020-11-16 13:58

　　 本研究中，将丙型肝炎病毒(HCV)基因组的5’非编码区(5’UTR)插入到报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)和荧光素酶(luciferase)的上游，并构建基于真核细胞Ⅲ型启动子的表达载体，这种载体能产生针对HCV5’UTR的小干扰RNA(siRNA)。然后将含有HCV 5’UTR的eGFP／luciferase和能产生小于扰RNA的质粒共转染入Hela细胞，通过测定细胞发出的荧光和化学发光强弱来观测抑制效果。实验结果表明，与HCV 5’UTR特异性小干扰RNA表达质粒共转染的细胞无论从定性还是从定量上所测得的荧光和化学发光强度都明显低于阴性对照，且细胞密度经核染色与对照组无明显区别。这揭示了小干扰RNA确实能引起HCV特异基因如5’UTR的沉默，且转染进去的小干扰RNA表达质粒对细胞没有毒害作用。这一工作是通过载体直接在细胞内表达小干扰RNA(siRNA)而不是化学合成的，可以使小干扰RNA在细胞内得到稳定表达，因此本研究设计的siRNA表达载体不仅可以有效沉默HCV 5’UTR，而且该系统可以灵敏地筛选更有效的针对HCV的siRNA，因而这一结果为研究利用RNA干扰进行基因治疗HCV感染做了初步探索。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【文章目录】：
Ⅰ 前言
    1.1 HCV基因组结构及其蛋白功能
    1.2 HCV的生活特性
    1.3 当前主要的HCV体外细胞复制模型
    1.4 当前主要的HCV动物模型
    1.5 RNA干扰现象的发现
    1.6 RNA干扰的分子机制
    1.7 RNA干扰在抗人类恶性病毒方面的研究进展
Ⅱ 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病人血清与细胞
        2.1.2 质粒和菌株
        2.1.3 细菌与细胞培养所用溶液
        2.1.4 提取病毒RNA所用的试剂与溶液
        2.1.5 RT反应所用试剂
        2.1.6 其他反应所用试剂
        2.1.7 PCR产物的回收，克隆，鉴定所用试剂与溶液
        2.1.8 碱裂解法小量提质粒试剂
    2.2 方法
        2.2.1 病毒RNA的提取
        2.2.2 RT反应
        2.2.3 引物设计与合成
        2.2.4 PCR反应
        2.2.5 PCR或酶切产物的回收
        2.2.6 PCR回收产物与pGEM-T载体法的连接与转化
        2.2.7 重组质粒的筛选与鉴定
        2.2.8 EGFP-5’UTR的构建
        2.2.9 pGL3／CMV与pGL3／CMV-5’UTR的构建
        2.2.10 表达小干涉RNA载体pSilencer-5’UTR的构建
        2.2.11 细胞培养
        2.2.12 DNA的转染
        2.2.13 绿色荧光的观察与荧光素酶活性的检测
        2.2.14 细胞核的染色
Ⅲ 结果与分析
    3.1 从血清中HCV5’UTR的扩增与序列测定
    3.2 重组质粒的筛选与鉴定
    3.3 以HCV 5’UTR为前导序列的报告基因能够正常表达
    3.4 针对5’UTR设计的小干扰RNA能特异性地抑制含有5’UTR的报告基因的表达
Ⅳ 讨论
研究总结
参考文献
附录
致谢

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 毕胜利,白宪鹤,丛勉尔,田厚文,孙得贵,H.S.Margolis,刘崇柏;中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异[J];病毒学报;1993年02期

本文编号：2886311