弓形虫ROP2、SAG1基因的克隆及表达和复合基因SAG1/ROP2的构建及表达

发布时间：2021-01-26 23:52

　　背景：弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫，全球分布，能引起人兽共患的弓形虫病，全世界约1／3人口感染，大多数为隐形感染，但对于孕妇和免疫功能抑制或低下者，能造成严重危害，孕妇感染常引起流产、畸胎、死胎等，对于肿瘤患者或AIDS病人等免疫功能受损者，弓形虫是引起死亡的主要病原体之一。同时，弓形虫对畜牧业生产也造成了严重危害。因此，弓形虫病的诊断和疫苗研究成为弓形虫病防治工作的重点。筛选和获得敏感性好、特异度高的抗原是诊断和疫苗研究的基础。SAG1蛋白为弓形虫速殖子期特异性抗原，ROP2蛋白为弓形虫生活史各期均分泌的抗原，具有高度的保守性和免疫原性，已成为弓形虫病诊断和疫苗研究的候选分子。 目的：分别克隆和表达SAGI和 ROPZ基因，筛选诊断抗原；构建SAGI八 复合基因，进行疫苗研究。 方法：1．利用PCR技术从弓形虫基因组中扩增出ROPZ基因，并将其克隆到PGEX个Tl进行表达和鉴定。 2．通过PCR将SAGI基因从弓形虫基因组中调出，并克隆到pGEX－4T－1和pET32a中分别进行表达和鉴定。 3．通... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒pGEX一4T一1一ROPZ的酶切及PCR鉴定M:分子最标准;1:EeoRI酶切pGEX一4T一l;2:EeoRI酶切pGEX一4‘r一l一R()PZ;3:ECoRI+Sall双酶切pGEX一4T一l一ROPZ;4:pGEX一4T一l一ROPZ质粒PCR扩增产物;5:

}}}1582CGG图1一4克隆的ROPZ基因序列与己发表的ROPZ基因序列的比较上行:克隆的ROPZ基因序列;下行:己发表的ROPZ基因序列Fig.1一4AlignmentofnueledtidesequeneeoftheelonedropZgeneandtherePortedroPZgeneUpperline:theelonedropZgene:lowerline:thereportedropZgene.四、弓形虫ROPZ基因在大肠杆菌中的表达(一)ROPZ基因在大肠杆菌中的诱导表达经工PTG诱导，弓形虫ROPZ基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了表达。通过SDS一PAGE检测，发现融合表达产物大小为55Kda，与理论值基本吻合，而空载体在26Kda的位置表达了GST担体蛋白。234563一，.刃j目自巨上﹃﹃︺-三竺丛翅鱼鱼鱼违L三尘鱼图1一5重组蛋白GST/ROPZ的SnS一PAGE分析

量标准;l:未诱导的BL21(DE3);2:诱导后的BL21(DE3);34T一1/BLZI;4:诱导后的pGEX一4T一l/BL21;5:未诱导的pGEX一ROPZ/BL21;诱导后的pGEX一4T一1一ROPZ/BLZI1一5SDS一PAGEanalysisofthereeombinantproteinGST/ROeinmarker:Lane1BL21(DE3)withoutinduetion;Lane2BLetion:Lane3pGEX一4T一1/BLZIwithoutinduetion:Lane4prinduetion:Lane5pGEX一4T一1一ROPZ/BL21withoutinduetio6pGEX一4T一1一ROPZ/BL21afterinduetion.条件的优化:机菌生长的不同时期(OD600分别为0.1，0.2，0.4，0.6，组蛋白的诱导表达，工PTG终浓度为0.Ilnlnol/L，诱导导温度为37℃。表达产物经SDS--队GE电泳染色后，同情况下，以0D60。值为0.6时开始诱导表达效果较:100稀释培养2.5h左右)。

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3002041