烟酰胺磷酸核糖转移酶基因编辑对人胚胎干细胞生长影响的研究

发布时间：2021-03-07 16:11

　　目的研究烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt）基因在人胚胎干细胞生长中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技术对人胚胎干细胞H9细胞系的Nampt基因进行移码突变;随后,筛选Nampt基因突变细胞系进行基因测序,同时在显微镜下观察其生长状态。另外,给予H9细胞不同浓度的Nampt抑制剂FK866进行干预,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。结果 Nampt基因发生突变后,人胚胎干细胞会逐渐死亡。同样,Nampt抑制剂FK866也会抑制胚胎干细胞的活力,使细胞逐渐死亡。结论 Nampt基因对维持人胚胎干细胞生长具有不可或缺的重要作用。 

【文章来源】：药学实践杂志. 2019,37(03)

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

图１Ｎａｍｐｔ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９质粒载体示意图

胞电转后降低嘌呤霉素筛选浓度（０．１μｇ／ｍｌ）筛选５ｄ。待细胞系扩增后，挑取上述的单克隆提取ＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增后测序。结果显示也无被编辑的细胞系。（３）为减少细胞死亡，在电转后第１天添加ＲＯＣＫ抑制剂Ｙ２７６３２（１０μｍｏｌ／Ｌ）（仅第１天使用）［１１］，同时进行０．３μｇ／ｍｌ嘌呤霉素抗性筛选，３ｄ后得到混合细胞系，提取ＤＮＡ后，进行ＰＣＲ扩增测序。测序结果显示Ｎａｍｐｔ基因３个碱基被删除，见图２。７ｄ后再次对该混合细胞系提取ＤＮＡ进行ｓａｎｇｅｒ测序，结果显示Ｎａｍｐｔ基因未被编辑。上述结果提示，Ｎａｍｐｔ基因突变是成功的，因为在电转后的较早期（第３天），细胞ＤＮＡ测序结果显示Ｎａｍｐｔ基因的３个碱基被删除。但是电转后期（第５天、第７天）检测不到Ｎａｍｐｔ基因突变的细胞，说明该基因突变细胞已死亡。图２基因测序结果注：框内为删除的３个碱基３．３Ｎａｍｐｔ抑制剂ＦＫ８６６给药结果如图３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制剂ＦＫ８６６对胚胎干细胞的生长抑制率分别为（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各剂量组均有统计学差异，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干细胞的生长呈剂量依赖性。从３ｎｍｏｌ／Ｌ剂量开始，ＦＫ８６６几乎完全抑制胚胎干细胞生长。图３ＦＫ８６６对胚胎干细胞生长的影响＊＊Ｐ＜０．０５，与对照组比较４讨论Ｎａｍ

ｐｔ基因３个碱基被删除，见图２。７ｄ后再次对该混合细胞系提取ＤＮＡ进行ｓａｎｇｅｒ测序，结果显示Ｎａｍｐｔ基因未被编辑。上述结果提示，Ｎａｍｐｔ基因突变是成功的，因为在电转后的较早期（第３天），细胞ＤＮＡ测序结果显示Ｎａｍｐｔ基因的３个碱基被删除。但是电转后期（第５天、第７天）检测不到Ｎａｍｐｔ基因突变的细胞，说明该基因突变细胞已死亡。图２基因测序结果注：框内为删除的３个碱基３．３Ｎａｍｐｔ抑制剂ＦＫ８６６给药结果如图３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制剂ＦＫ８６６对胚胎干细胞的生长抑制率分别为（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各剂量组均有统计学差异，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干细胞的生长呈剂量依赖性。从３ｎｍｏｌ／Ｌ剂量开始，ＦＫ８６６几乎完全抑制胚胎干细胞生长。图３ＦＫ８６６对胚胎干细胞生长的影响＊＊Ｐ＜０．０５，与对照组比较４讨论Ｎａｍｐｔ是哺乳动物体内ＮＡＤ生物合成的重要限速酶，在生物体内具有多种生理功能［６，１２］。另外，Ｎａｍｐｔ基因全身敲除的小鼠无法存活也说明了Ｎａｍｐｔ在生物体内的重要性［１３］。本课题组在Ｎａｍｐｔ相关研究上做了大量工作，尤其是发现其在缺血性脑卒中的亚急性期和慢性期可以通过促进血管新生和神经再生从而促进神经功能的恢复［１４－１５］。这些结果都提示Ｎａｍｐｔ在细胞的增殖分化上具有重要作用，但是目前Ｎａｍｐｔ在胚胎干


本文编号：3069418