人降钙素原的原核表达及其单克隆抗体的制备

发布时间：2021-05-11 20:49

　　目的:原核表达人降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,制备高纯度的PCT单克隆抗体。方法:将构建的PCT-pET22b表达载体转入大肠埃希菌BL21中诱导表达PCT蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,用蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定。获得的PCT重组蛋白采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆4次。将细胞株注入小鼠腹腔收集腹腔积液获得单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法进行纯化。结果:SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量约14 k Da处有一明显条带,与目的蛋白大小相符。蛋白质印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT。采用细胞融合技术成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞,将其命名为B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2。选B3和C4细胞株通过体内诱生法制备单克隆抗体,经纯化后纯度可达95%以上。间接ELISA法检测B3、C4抗体效价均可达10⁷,亲和常数分别为5. 06×10⁸,7. 3×10⁸。结... 

【文章来源】：江苏大学学报(医学版). 2019,29(03)

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 动物和细胞株
    1.2 主要试剂和仪器
    1.3 PCT重组蛋白的表达、纯化与鉴定
    1.4 杂交瘤细胞的制备
        1.4.1 动物免疫
        1.4.2 制备饲养细胞
        1.4.3 细胞融合
    1.5 小鼠体内诱生法制备PCT单克隆抗体
    1.6 单克隆抗体的纯化
        1.6.1 辛酸硫酸铵法粗提抗体
        1.6.2 Protein G亲和层析法纯化
    1.7 单克隆抗体纯度、效价、亲和力分析
        1.7.1 纯度
        1.7.2 间接ELISA法测定单克隆抗体的效价
        1.7.3 间接ELISA法测定单克隆抗体的亲和力
2 结果
    2.1 PCT重组蛋白的表达、纯化与鉴定
    2.2 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
    2.3 单克隆抗体性质的初步测定
        2.3.1 纯度鉴定
        2.3.2 抗体效价测定
        2.3.3 抗体亲和力测定
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]单个B细胞制备CRP单克隆抗体及其ELISA检测体系的初步建立[J]. 林骏,山云,刘谦,王晓炜,王洪涛,刘尧.  中国免疫学杂志. 2019(01)
[2]降钙素原的原核表达及鉴定[J]. 蒋棚俊,吴胜昔,王玲玲,李令臣,李俊萱,曾政,梁望旺,李志.  重庆理工大学学报(自然科学). 2018(06)
[3]新型量子点免疫荧光层析法检测降钙素原试剂盒临床应用评价[J]. 何国炜,黄建华,林秀梅,宋志兴.  中国卫生检验杂志. 2017(04)
[4]血清PCT、CRP及内毒素在细菌性血流感染所致脓毒症患者中的早期诊断价值[J]. 杨辉,罗倩,陈君灏,杨森,张珏.  现代生物医学进展. 2017(02)
[5]降钙素原对全身炎症反应综合征患者病情预后的判断价值分析[J]. 李莉.  世界最新医学信息文摘. 2016(88)
[6]免疫透射比浊法检测降钙素原的方法学评价[J]. 胡孝彬,张梦玲,曾静,郑凡.  实用医技杂志. 2014(12)



本文编号：3182083