IL-35修饰的间充质干细胞免疫调节性能初探

发布时间：2017-04-25 01:00

  本文关键词：IL-35修饰的间充质干细胞免疫调节性能初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本实验通过分离大鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),使用携带IL-35基因片段的表达载体转染MSCs细胞,在体外建立MSCs与DC、T细胞共培养体系,探讨修饰后的MSCs的免疫调节作用。方法:(1)无菌条件下分离Sprague-Dawley(SD)大鼠股骨和胫骨,使用全骨髓贴壁法培养MSCs,胰酶消化传代培养。待培养至第3代时进行流式检测,鉴定分离的MSCs体外分化的潜能。(2)使用LPS处理3天的人外周血单核细胞c DNA为模板,扩增获得EBi3和p35基因片段,再通过重叠PCR方法,人工合成了IL-35片段,将其克隆进真核表达载体p MSCV-IRES-GFP中,提取质粒后瞬时转染MSCs,Real-time PCR检测修饰后的MSCs基因表达情况,ELISA检测细胞上清中IL-10、TGF-β1、IL-12的分泌情况。(3)密度梯度离心法分离培养Wistar大鼠骨髓未成熟DC细胞,建立修饰后的MSCs与DC细胞的体外共培养体系,分为直接接触组和间接接触组,流式检测共培养48小时后DC表型的变化,ELISA检测DC细胞分泌IL-12的变化情况。(4)建立修饰后的MSCs与脾脏T细胞的体外共培养体系,分为直接接触组和间接接触组,流式检测CD8+T细胞和CD4+CD25+调节T细胞(Tregs)水平,MTS检测T细胞增殖,Real-time PCR检测与T细胞共培养后MSCs的IL-10和TGF-β基因表达情况。结果:(1)使用全骨髓贴壁法培养的MSCs成细长梭形状,形似成纤维细胞,排列均匀,成漩涡状生长,流式检测其高表达CD29、CD44和CD90分子,分别为84.12%、90.77%、97.27%,而几乎不表达造血系的CD34和CD45分子,分别为1.87%、1.06%。证实所获得的MSCs为典型的间充质干细胞,第三代MSCs在体外经诱导后可向脂肪细胞和软骨细胞分化,证实其具有良好的分化潜能。(2)PCR扩增获得630bp的EBi3片段和590bp的p35成熟片段,通过重叠PCR的方法,人工合成了IL-35基因片段(1.3kb),并成功将其克隆进真核表达载体p MSCV-IRES-GFP中,双酶切鉴定显示连接成功。提取质粒后瞬时转染MSCs,检测到修饰后MSCs表达IL-35显著增强,同时与IL-35相关的免疫因子IL-10和TGF-β1的表达也明显升高。ELISA检测细胞上清显示转染修饰的MSCs分泌IL-10和TGF-β1水平明显增高,而IL-12的分泌水平明显下降。(3)通过密度梯度离心法获得大鼠DC,流式检测其表面成熟分子标志物CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ处于较低水平,分别为45.11%、70.15%、82.56%。使用LPS诱导后,CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ水平明显升高,分别为78.2%、97.1%、99.47%。在MSCs与DC共培养体系中加入LPS诱导DC成熟,DC的最主要成熟标志CD86仍处于较低水平,MSC-IL35组和直接接触组中显示出更强劲抑制效力。共培养后细胞上清ELISA显示DC分泌的IL-12水平明显下降,且在MSC-IL35组下降更为明显。(4)通过红细胞裂解法获得大鼠脾脏T细胞,MSCs与T细胞共培养后降低了CD8+T水平,增加了CD4+CD25+Tregs水平,MSC-IL-35的作用更为明显,MTS检测显示在共培养后24小时和48小时,MSCs明显抑制了T细胞的增殖,而MSC-IL-35的抑制作用更加明显。Real-time PCR检测结果显示与T细胞共培养后MSCs的IL-10和TGF-β1基因表达显著增强,其中与T细胞直接接触组效果更为明显。结论:转染修饰后的MSCs能通过直接接触和分泌细胞因子来抑制LPS所诱导的DC细胞的成熟,降低T细胞亚群CD8+T细胞的比例,增加CD4+CD25+Tregs水平,且比普通MSCs效果更为明显,IL-35修饰后的MSCs具有更为强大的免疫调节效力,在器官移植耐受领域有更大的应用前景。
【关键词】：间充质干细胞 白介素35 大鼠 免疫调节 转染 CD4+CD25+调节性T细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.12
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语10-12
• 前言12-14
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、间充质干细胞的分离与培养14-22
• 1.1 对象和方法14-17
• 1.1.1 研究对象14
• 1.1.2 实验材料14-16
• 1.1.3 实验方法16-17
• 1.2 结果17-19
• 1.2.1 MSCs的形态特征17-18
• 1.2.2 MSCs的冻存与复苏18
• 1.2.3 流式细胞仪检测MSCs表面标志物18-19
• 1.2.4 MSCs体外诱导鉴定19
• 1.3 讨论19-21
• 1.4 小结21-22
• 二、IL-35基因修饰大鼠MSCs22-35
• 2.1 对象和方法22-29
• 2.1.1 研究对象22
• 2.1.2 实验材料22-24
• 2.1.3 实验方法24-29
• 2.2 结果29-32
• 2.2.1 重叠PCR获得EBi3-p35片段29-30
• 2.2.2 重组质粒pMSCV-IL35GFP的鉴定30-31
• 2.2.3 MSCs修饰后的鉴定31-32
• 2.2.4 经IL-35修饰的MSCs相关细胞因子分泌量变化32
• 2.3 讨论32-34
• 2.4 小结34-35
• 三、IL-35基因修饰MSCs对DC的影响35-43
• 3.1 研究对象和方法35-38
• 3.1.1 研究对象35
• 3.1.2 实验材料35-36
• 3.1.3 实验方法36-38
• 3.2 结果38-41
• 3.2.1 DC细胞的形态特征38-39
• 3.2.2 DC细胞表面表型39-40
• 3.2.3 MSC及MSC-IL35抑制LPS所诱导的DC成熟40
• 3.2.4 共培养后DC上清中IL-12含量检测40-41
• 3.3 讨论41-42
• 3.4 小结42-43
• 四、IL-35基因修饰MSCs对T细胞的影响43-51
• 4.1 研究对象和方法43-47
• 4.1.1 研究对象43
• 4.1.2 实验材料43-44
• 4.1.3 实验方法44-47
• 4.2 结果47-49
• 4.2.1 MSCs对脾脏T细胞分型的影响47-48
• 4.2.2 MTS检测结果48-49
• 4.2.3 Real-time PCR检测结果49
• 4.3 讨论49-50
• 4.4 小结50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-57
• 发表论文和参加科研情况说明57-58
• 综述 MSCs的生物学特性及其在器官移植领域的应用前景58-70
• 综述参考文献65-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Sait Murat Do?an;Sel?uk K?l?n?;Eyüp Kebap??;Cem Tu?men;Mustafa ?lmez;Cezmi Karaca;Alp Gürkan;Ma?allah Baran;Yusuf Kurtulmu?;;Mesenchymal stem cell therapy in patients with small bowel transplantation:Single center experience[J];World Journal of Gastroenterology;2014年25期

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本文编号：325276