重组人G-CSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面表达文库的构建和抗-G-CSF抗体片段及其可变区基因的鉴定

发布时间：2021-06-29 20:18

　　粒系集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factors，G-CSF），具有特异地刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化等作用，因此在放射性损伤的救治以及肿瘤患者放化疗等方面具有良好的应用前景。但G-CSF也与体内炎症等严重病理过程中嗜中性白细胞的大量增加和激活有关。后者又可因“呼吸暴发”效应释放大量氧自由基等成份，在清除异己的同时，对自身组织也产生影响。保持体内粒细胞的动态平衡是对一些临床疾病诊治的重要环节，其中研制和应用抗G-CSF抗体也将是一个重要方面。本研究利用90年代以来发展起来的在基因工程抗体领域具有重大突破的全套噬菌体抗体表面表达技术，对抗G-CSF单链抗体（ScFv）进行了研究。从人重组G-CSF免疫的小鼠脾细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体V_H、V_L扩增，经重叠延伸反应在体外随机装配成ScFv。将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB 5E中。电转化含Sup E的E．coli菌株，以辅助噬菌体M13KO7超感染噬菌粒文库，构建成全套ScFv基因... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：102 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

pCANTABSE测序引物实验中所用各种限制性内切酶以及其它有关分子生物学试剂均为BoehrnigerManneim公司、pharmaeia公司、Biolabs公司或华美公司产品

加入针对鼠IgV区基因不同家族的重链和‘轻链可变区引物进行PCR，即得到了全套杭体重链可变区基因(VHgeneerPertoier)和全套杭体轻链可变区基因(VLgenerepertoire)。电泳结果见图9。结果显示扩增出的VH、VL(VK)基因片段约为35b0p左右，VH基因略大于VL基因片段，与预期的片段大小相符，非一42一

517bP—图10全套ScFv基因的PCR扩增结果SeFv:SeFv基因扩增产抽;M:pBR322/Hinfl大量单菌落形成。从连接产物转化菌平皿上随机挑选了22个单菌菌拉DNA，以EcoRI、Hnidl酶切鉴定，有15个单菌落所提噬菌了约为2.Ikb左右的条带(含有外源插段)与预测结果一致，(见图个单菌落则小于或无2.kIb之条带，表明无大小正确的外源片段的12)。以上结果表明克隆基本成功。将所有菌落冲洗下来收集，进行达。123456789101112131415M

【参考文献】：
期刊论文
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[3]溶血与非溶血时血浆及红细胞过氧化氢诱发化学发光值比较[J]. 贾松惠,李立文,孙志东,路文胜,温光楠.  中国病理生理杂志. 1995(03)



本文编号：3257094