两株裂解性粪肠球菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

发布时间：2017-04-28 00:10

  本文关键词：两株裂解性粪肠球菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,抗生素和免疫抑制剂的广泛应用以及肠球菌多重耐药菌株的不断出现,肠球菌引起的医院内感染逐渐增多。特别是艾滋病人、接受化疗的癌症患者、术后和器官移植病人易患肠球菌感染。在全球范围内,肠球菌感染主要是由粪肠球菌和屎肠球菌引起。研究显示,肠球菌对头孢菌素的固有耐药性、以及对万古霉素耐药性增加的趋势,导致肠球菌感染的治疗面临诸多困难。噬菌体是一类能够感染细菌的病毒,广泛存在于自然界。利用裂解性噬菌体控制细菌感染的噬菌体疗法又重新引起人们的关注。因此,积极开展肠球菌噬菌体生物学特性的研究和肠球菌感染的噬菌体疗法,具有重要的现实意义和潜在的应用价值。 本项研究以12株粪肠球菌和8株屎肠球菌为宿主菌,从医院污水站中分离出4株裂解性粪肠球菌噬菌体,分别命名为φEc-ZZ2、φEc-ZZ3、φEc-ZZ7和φEc-ZZ8。形态学观察发现,这4株新分离的噬菌体属于有尾病毒目(Caudovirale order)中的长尾病毒科(Siphovridae)噬菌体。我们对噬菌体φEc-ZZ2和φEc-ZZ8的生物学特性进行了初步研究,通过基因测序分析了噬菌体φEc-ZZ2的基因组。结果显示：(1)噬菌体φEc-ZZ2和φEc-ZZ8的头部均呈立体对称、直径约40nm,尾部呈丝状、长约200nm；(2)噬菌体φEc-ZZ2对20株肠球菌的裂解率为45%,而φ-ZZ8的裂解率为30%；(3)DNA限制性酶切图谱表明：噬菌体φEc-ZZ2和φ-ZZ8基因组都含有Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ、Nde Ⅰ和XbaI的酶切位点；(4)一步生长曲线表明,噬菌体φEc-ZZ2的潜伏期为10min,爆发量为100PFU/cell；噬菌体φEc-ZZ8的潜伏期为15min,爆发量为150PFU/cell；(5)SDS-PAGE蛋白电泳发现,φEc-ZZ2有2条主要蛋白带和5条次要蛋白带,φEc-ZZ8有3条主要蛋白带和至少8种次要蛋白带,两株噬菌体的相对分子质量范围都在10-130kDa之间；(6)在稳定性试验中,噬菌体φEc-ZZ2和φEc-ZZ8在60℃30min后以及在pH4～10的范围内仍具有裂解宿主细胞的活性；(7)基因组测序发现,φEc-ZZ2基因组大小为41,170bp,GC含量34.59%。基因组有59个基因(总长度为35,760bp,占基因组全长的86.86%),1个scaffold,1个contig,2个小卫星序列,无微卫星序列、无tRNA和rRNA。 通过对分离的粪肠球菌噬菌体的初步研究,获得以下结论： 1.粪肠球菌噬菌体φEc-ZZ2、φEc-ZZ3、φEc-ZZ7和φEc-ZZ8为裂解性噬菌体,其形态学特征符合有尾病毒目(Caudovirale order)中的长尾病毒科(Siphoviridae family)噬菌体。 2.噬菌体φEc-ZZ2和φEc-ZZ8所具有的潜伏期短、裂解效率高、宽裂解谱以及在60℃和pH4-10条件下仍具有裂解活性等特征,为噬菌体疗法应用于耐药性肠球菌的感染提供了依据。 3.基因测序表明,噬菌体φEc-ZZ2基因组为双链DNA,大小为41,170bp,GC含量34.59%。基因组有59个基因,总长度为35,760bp。
【关键词】：噬菌体疗法 噬菌体 肠球菌 耐万古霉素肠球菌
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英语缩写和中英文全称对照表10-11
• 第1章 文献回顾11-17
• 1、肠球菌概述11-12
• 2、噬菌体的发现及初期研究12-15
• 3、其他革兰阳性球菌的噬菌体研究进展15-16
• 4、噬菌体研究的发展前景16-17
• 第2章 两株裂解性粪肠球菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析17-38
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 宿主菌17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.1.3 主要仪器18-19
• 2.2 方法19-24
• 2.2.1 肠球菌的准备19
• 2.2.2 标本的来源及其处理19
• 2.2.3 肠球菌噬菌体分离19-20
• 2.2.4 噬菌体的扩增及滴度的测定20
• 2.2.5 噬菌体电镜观察20-21
• 2.2.6 噬菌体交叉裂解试验21
• 2.2.7 噬菌体稳定性试验21
• 2.2.8 噬菌体核酸的提取及酶切分析21-22
• 2.2.9 肠球菌噬菌体的SDS-PAGE凝胶电泳22-23
• 2.2.10 噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定23
• 2.2.11 噬菌体吸收率试验23-24
• 2.2.12 噬菌体一步生长曲线的测定24
• 2.3 结果24-36
• 2.3.1 肠球菌噬菌体的分离及扩增24-25
• 2.3.2 噬菌体的电镜观察25-27
• 2.3.3 噬菌体的交叉裂解结果27-28
• 2.3.4 噬菌体的稳定性试验结果分析28-30
• 2.3.5 噬菌体的核酸提取及酶切分析30-31
• 2.3.6 噬菌体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳31-32
• 2.3.7 最佳感染复数的测定32-33
• 2.3.8 噬菌体吸收率曲线的绘制33-34
• 2.3.9 噬菌体一步生长曲线的绘制34-36
• 2.4 讨论36-38
• 第3章 噬菌体φEC-ZZ2的全基因组测序与分析38-48
• 3.1 测序样品的准备38
• 3.2 样品φEc-ZZ2的全基因组分析38-48
• 第4章 结论48-49
• 参考文献49-54
• 作者简介及在读期间发表论文和参加课题54-55
• 致谢55

【参考文献】

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1 张文惠;安小平;范航;范华昊;李玉元;米志强;童贻刚;;一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究[J];生物技术通讯;2013年04期

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本文编号：331729