PTEN磷酸化修饰在HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及其调控机制

发布时间：2017-05-03 13:02

  本文关键词：PTEN磷酸化修饰在HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及其调控机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨PTEN的磷酸化修饰是否参与HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖及其磷酸化修饰的调控机制。方法:1以小鼠系膜细胞(mouse mesangial cell,MMC)为研究对象,100μg.L~(-1)HMGB1为刺激物,分别于刺激0 h、12 h和24 h收集细胞,Western blot技术检测PCNA蛋白表达变化;流式细胞术检测Brd U阳性细胞百分率。2以100μg.L~(-1)HMGB1刺激MMC,分别于刺激0 min、10 min、30 min、60 min和120 min时收集细胞,Western blot技术检测p-PTEN-Ser380、p-PTEN-Ser370、p-S6K-Thr389、S6K蛋白表达。3将常规培养的MMC随机分为对照组(control group)、HMGB1刺激组(HMGB1 group)、HMGB1+空载质粒转染组(H+EV)、HMGB1+PTEN非磷酸化质粒转染组(H+S380A)和HMGB1+PTEN持续磷酸化质粒转染组(H+S380D),以Brd U掺入结合免疫荧光技术检测Brd U表达;免疫细胞化学技术检测Ki67蛋白的表达。4将常规培养的MMC随机分为control group、HMGB1 group和HMGB1+PF-4708671 group,先加入25μmol.L~(-1)的PF-4708671预处理24 h,再更换为含100μg.L~(-1)HMGB1的培养基,继续孵育10min、30min和24 h,Western blot技术检测p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389、S6K和PCNA蛋白的表达变化。结果:1 HMGB1能够上调小鼠系膜细胞的增殖水平1.1流式细胞术检测结果显示:与HMGB1刺激0 h组相比,HMGB1刺激12 h组Brd U阳性细胞百分率有所升高,但差异无统计学意义;而HMGB1刺激24 h时,其阳性细胞百分率明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。1.2 Western blot结果显示:与HMGB1刺激0 h组相比,HMGB1刺激12h组与HMGB1刺激24 h组PCNA蛋白表达明显升高,并且HMGB1刺激24 h时PCNA蛋白表达高于HMGB1刺激12 h时,差异均具有统计学意义(P0.05)。2 HMGB1诱导小鼠系膜细胞中PTEN(Ser380)发生磷酸化修饰(p-PTEN-Ser380)Western blot结果显示:HMGB1刺激10 min时p-PTEN-Ser380水平升高,30 min达高峰,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05);随后降低,120 min时回落至正常水平;而HMGB1刺激各时间点,PTEN(Ser370)的磷酸化水平(p-PTEN-Ser370)均无明显变化。3 PTEN(Ser380)的磷酸化参与HMGB1诱导的系膜细胞增殖Brd U掺入法细胞免疫荧光检测结果显示:与对照组相比,HMGB1刺激组Brd U阳性细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);与HMGB1刺激组相比,HMGB1+空载质粒转染组Brd U阳性细胞百分率无明显变化,HMGB1+PTEN非磷酸化质粒转染组Brd U阳性细胞百分率明显下降,HMGB1+PTEN持续磷酸化质粒转染组Brd U阳性细胞百分率明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。免疫细胞化学检测结果显示:Ki67阳性信号主要定位于细胞核,与对照组相比,HMGB1刺激组Ki67阳性细胞百分率明显上调,差异具有统计学意义(P0.05);与HMGB1刺激组相比,HMGB1+空载质粒转染组Ki67阳性细胞百分率无明显变化,HMGB1+PTEN非磷酸化质粒转染组Ki67阳性细胞百分率明显下降,而HMGB1+PTEN持续磷酸化质粒转染组Ki67阳性细胞百分率明显上调,差异均具有统计学意义(P0.05)。4 HMGB1促进小鼠系膜细胞中S6K(Thr389)发生磷酸化Western blot结果显示:与HMGB1刺激0 min组相比,HMGB1刺激10 min后S6K(Thr389)磷酸化水平(p-S6K-Thr389)升高,30 min时有所回落,但仍高于正常对照组,差异均具有统计学意义(P0.05),60 min和120 min接近正常水平;HMGB1刺激各时间点,总S6K表达无明显变化。5 PF-4708671能够抑制HMGB1诱导的小鼠系膜细胞中p-PTEN-Ser380、PCNA、p-S6K-Thr389蛋白的表达Western blot结果显示:与对照组相比,HMGB1刺激组中p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和PCNA蛋白表达水平明显上调;而与HMGB1刺激组相比,HMGB1+PF-4708671组p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和PCNA蛋白表达水平明显下降,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:1 HMGB1能够促进小鼠系膜细胞中PTEN(Ser380)发生磷酸化修饰;2 PTEN(Ser380)磷酸化修饰参与了HMGB1诱导的系膜细胞增殖;3 HMGB1介导的PTEN(Ser380)磷酸化修饰是通过S6K磷酸化实现的。
【关键词】：高迁移率族蛋白1 与张力蛋白同源第10染色体丢失的磷酸酶 磷酸化 核蛋白体S6激酶 Ki67 增殖细胞核抗原 细胞增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-24
• 结果24-26
• 附图26-35
• 附表35-39
• 讨论39-43
• 结论43-44
• 参考文献44-49
• 综述 PTEN与相关疾病的研究进展49-72
• 参考文献61-72
• 致谢72-73
• 个人简历73-74

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