伤寒沙门菌非编码RNA AsrH验证与表型研究

发布时间：2017-05-03 14:10

  本文关键词：伤寒沙门菌非编码RNA AsrH验证与表型研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:近来,本研究组通过对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)转录组的分析,新发现了很多非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA),其中有一可能为rpo H基因对侧编码的nc RNA,称为Asr H,本论文拟进行Asr H表达鉴定和分子特性分析,观察其在S.Typhi中的作用。方法:1.Asr H的鉴定:通过Northern Blot证实Asr H在S.Typhi中的存在性,并通过Northern Blot和q RT-PCR观察其生长时相的表达特性。2.Asr H的分子全长鉴定:通过5′RACE、Tiling PCR来找出Asr H的转录起始点、可能的转录终止点,测出Asr H分子的大概全长。3.基因缺陷变异株的制备:通过自杀质粒p GMB151介导构建S.Typhi asr H基因启动子缺陷变异株。4.asr H变异株的半定量验证:用RT-PCR分析S.Typhi野生株(简称“WT”)和asr H变异株中asr H和rpo H的表达情况。5.生长曲线测定:描制生长曲线,观察WT、asr H基因启动子缺陷株在四种不同环境下(等渗、高渗应激、氧应激、酸应激)时的生存情况。6.动力试验:半固体动力培养板(0.3%)上培养细菌,观察比较asr H启动子缺陷变异株、WT的动力情况。7.生物膜形成试验:生物膜结晶紫染色观察asr H启动子缺陷变异株、WT的生物膜形成情况。结果:1.Northern blot与q RT-PCR表明Asr H在S.Typhi中确实存在,而且在生长对数晚期(OD600=1.2)的时候表达量最高。2.经过5′RACE和Tiling PCR分析,推断Asr H分子全长在846bp-1007bp之间,转录起始点位于rpo H基因终止码下游119bp,转录方向相反,能覆盖大部分的rpo H基因编码区,中间没有完整的ORF结构,因此Asr H为一长非编码RNA。3.自杀质粒p GMB151介导敲制asr H基因启动子区域缺失120bp的变异株。4.在asr H缺陷株中asr H基因不表达,rpo H基因正常表达。在WT中asr H和rpo H基因两者都表达。5.生长曲线显示,在一定时间内,与WT相比,酸、高渗应激下asr H缺陷株的生存能力显著降低,而在氧应激下则相反。6.动力试验显示,与WT相比,asr H启动子缺陷株的动力几乎完全丧失。7.生物膜显示,asr H启动子缺陷株生物膜形成能力强于WT。结论:证实了nc RNA Asr H在S.Typhi中的存在表达,Asr H分子大概全长在846bp-1007bp之间。Asr H能影响S.Typhi在应激环境下的生存能力,且对细菌的动力至关重要,而对与生物膜的形成有抑制作用。
【关键词】：伤寒沙门菌 AsrH 生物膜 动力 生长曲线
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 英文缩略语12-13
• 1 绪论13-17
• 1.1 伤寒沙门菌简介13-14
• 1.2 细菌中的非编码RNA14-15
• 1.3 S. Typhi中的非编码RNA的研究15-16
• 1.4 本课题研究由来16-17
• 2 本文研究目的、内容及实验路线17-20
• 2.1 研究目的17
• 2.2 研究内容17
• 2.3 实验方案设计及路线17-20
• 2.3.1 S. Typhi中ncRNA AsrH验证及结构初步分析17-18
• 2.3.2 S. Typhi中ncRNA AsrH表达特性分析18
• 2.3.3 S. Typhi中ncRNA AsrH作用初步研究18-20
• 3 实验材料与方法20-43
• 3.1 实验材料20-22
• 3.1.1 菌株和质粒20
• 3.1.2 主要试剂20
• 3.1.3 主要溶液20-22
• 3.1.4 主要仪器22
• 3.2 实验方法22-43
• 3.2.1 S. Typhi培养22-23
• 3.2.2 细菌总RNA的提取23
• 3.2.3 Northern blot分析S. Typhi中ncRNA Asr H的表达23-25
• 3.2.4 qRT-PCR分析S. Typhi中ncRNA AsrH的表达25-26
• 3.2.5 S. Typhi中ncRNA AsrH的分子全长鉴定26-34
• 3.2.6 S. Typhi中asrH基因启动子缺陷变异株的敲建及半定量验证34-41
• 3.2.7 非编码RNA Asr H对伤寒沙门菌表型的影响41-43
• 4 实验结果与讨论43-60
• 4.1 实验结果43-55
• 4.1.1 伤寒沙门菌非编码RNA AsrH的Northern Blot和qRT-PCR验证结果43-45
• 4.1.2 S .Typhi非编码RNA AsrH的分子全长鉴定45-47
• 4.1.3 S. Typhi asrH基因启动子缺陷变异株的制备敲建47-53
• 4.1.4 非编码RNA Asr H对伤寒沙门菌表型的影响53-55
• 4.2 讨论55-60
• 5 主要结论及展望60-61
• 5.1 主要结论60
• 5.2 展望60-61
• 参考文献61-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的文章68

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