人IgA/IgM Fc受体：Fcα/μR的表达和功能分析

发布时间：2022-08-02 14:43

　　Fcα/μR是一种新发现的IgA和IgM的Fc受体。人Fcα/μR为单基因家族成员,其基因位于1号染色体1q32区,毗邻其它FcR基因,包括FcγR1a、FcγR2、FcγR3、FcγR1a和pIgR。小鼠的Fcα/μR高亲和力的结合IgM,中等亲和力的结合IgA。人Fcα/μR为Ⅰ型跨膜蛋白,包含有522个氨基酸和3个膜外区结构域。其中Ig样结构域EC2与人、牛和小鼠的pIgR膜外区的第一个结构域有很高的序列同源性,提示这两个受体间可能存在亲缘上和功能上的关系。小鼠的Fcα/μR表达在胸腺、脾、肝、肾、小肠和大肠、睾丸和一些成熟的B细胞和单核细胞上。人的Fcα/μR表达在肾、小肠和二级淋巴器官。为了确定Fcα/μR在免疫系统中的作用,区分Fcα/μR与pIgR的表达和功能,我们制备了抗Fcα/μR与pIgR的单克隆抗体。Fcα/μR与pIgR的膜外区分别构建到pET30a质粒中,在E.coli中表达。得到的包涵体蛋白经纯化后免疫Balb/c小鼠并进行细胞融合。产生的单克隆抗体经ELISA、流失细胞分析、Western blott和免疫组化分析鉴定。用确定的特异性抗体进行组织人多组织器... 

【文章页数】：176 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
Standard Abbreviations
前言
    一、IgA生物学
        1、IgA的生物合成与代谢
        2、IgA的结构
        3、IgA的生物学功能
    二、IgA的Fc受体
        1、Fcα/μR的分布和表达调控
        2、Fcα/μR的基因结构
        3、Fcα/μR的蛋白质结构
        4、Fcα/μR与IgA、IgM的结合
        5、Fcα/μR的信号转导
        6、Fcα/μR介导的生理学功能
    三、本论文的研究目标
第一部分:抗人Fcα/μR和pIgR单克隆抗体的制备、纯化与鉴定
    一、实验材料
        1.细胞系
        2.菌株、质粒载体和cDNA克隆
        3.实验动物
        4.主要化学试剂
        5.主要抗体
        6.工具酶、分子量标准及试剂盒
        7.仪器设备
        8.溶液配制
    二、实验方法
        1.分子生物学常规实验操作
        2.目的蛋白的原核表达和纯化
        3.单克隆抗体的制备、筛选和保藏
        4.原核蛋白的复性重折叠
        5.Fcα/μR的真核细胞表达
        6.蛋白质的标记和交联
        7.IgA、IgM、sIgA的分离和纯化
    三、实验结果
        1.人Fcα/μR膜外区的原核表达
        2.抗-Fcα/μR的单克隆抗体的制备和筛选
        3.人Fcα/μR的真核细胞表达
        4.人pIgR膜外区的原核表达、复性和抗pIgR的抗体筛选
        5.人血清IgA的分离纯化
    四、讨论
第二部分:Fcα/μR和pIgR在多种组织器官的表达比较
    一、实验材料
        1.主要抗体
        2.仪器设备
        3.主要溶液配制
        4.多种正常器官组织芯片
    二、实验方法
        1.免疫组织化学实验
        2.石蜡切片的免疫荧光实验
    三、实验结果
        1.消化道:胃——小肠——阑尾——结肠——直肠
        2.淋巴组织:脾和扁桃体
        3.肝胆组织
        4.肺组织
        5.肾组织
        6.乳腺组织
        7.睾丸组织、前列腺组织
        8.脑组织
        9.心剧组织
        10.消化道Fcα/μR阳性细胞的其它抗体染色
    四、讨论
        1.基于核酸序列的Fcα/μR和pIgR电子表达谱分析
        2.基于蛋白序列和单抗的Fcα/μR和pIgR组织表达谱分析
        3.基于组织表达谱的Fcα/μR功能初探
第三部分:Fcα/μR在肾细胞上的表达和在IgA肾病中的作用
    一、实验材料
        1.IgA肾病及对照组病人资料
        2.IgA肾病病理组织切片
        3.细胞株
        4.抗体
    二、实验方法
        1.HK-2细胞上不同IgA受体的RT-PCR
        2.HMC,HMCL,HK-2和PTEC细胞上Fcα/μR的表达分析
        3.肾组织的免疫组织化学分析和免疫荧光双标实验
        4.HK-2和PTEC细胞结合IgA
        5.HK-2细胞吞噬IgA2、IgM和IgG3免疫复合物
        6.IgA病人血清或血清IgA细胞孵育实验
        7.统计学分析
    三、实验结果
        1.HK-2细胞上不同IgA受体的RT-PCR
        2.HMC,HMCL,HK-2和PTEC细胞上Fcα/μR的表达分析
        4.表达在HK-2细胞上的Fcα/μR为功能性IgA受体
        5.Fcα/μR和IgA在IgAN组织上的共定位分析
        6.IgAN病人的血清IgA可以上调HK-2细胞上的Fcα/μR表达
    四、讨论
综述:中性粒细胞上的Fc受体
    1.中性粒细胞膜上各种FcR的基本结构、分布和基因异质性
        1.1 FcγRⅠ(CD64)
        1.2 FcγRⅡ(CD32)
        1.3 FcγRⅢ(CD16)
        1.4 FcγR subunits
        1.5 FcαR(CD89)
    2.FcR的晶体结构和功能部位
        2.1 FcγR与IgG的结合
        2.2 FcαRⅠ与IgA的结合
    3.FcR介导的细胞信号转导
        3.1 FcR在细胞表面的聚集
        3.2 FcR迁入细胞膜上的特殊区域——脂阀(lipid raft)
        3.3 活化后细胞膜酪氨酸的磷酸化
    4.FcR介导的细胞生物功能
参考文献
附录1 攻读博士学位期间发表的文章情况
附录2 质粒载体图谱和多克隆位点
致谢



本文编号：3668713