冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化及结构影响的研究

发布时间：2017-05-17 12:15

  本文关键词：冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化及结构影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：1.检测精子库常规精液冷冻技术中冷冻保护剂、冷冻过程及冷冻时间长短三个因素对精子父源印记基因H19及母源印记基因MEST印记控制区域(imprinting control region, IC R)的DNA甲基化的影响程度,为冷冻精子在表观遗传方面的安全性提供参考依据。2.检测精子库常规精液冷冻技术对精子DNA完整性、膜完整性及顶体完整性的影响程度,为冷冻精子在结构方面的安全性提供参考依据。3.检测样品“雪域圣宝”对人类精子影响体外实验的效果。方法：1.以10例符合精子库捐精条件的正式志愿者为研究对象,将其每份精液样品平均分为4组：A组为新鲜精液,作为对照；B组加入同体积冷冻保护剂,不冷冻；C组加同体积冷冻保护剂,冷冻2d；D组加同等体积冷冻保护剂,冷冻两个月。通过亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)分析父源印记基因H19及母源印记基因MESTICR的DNA甲基化状态。2.以10例符合精子库捐精条件的初筛志愿者为研究对象,对照组为新鲜精液,实验组加同体积的冷冻保护剂,冷冻7d。通过精子染色质扩散实验(SCD)检测精子DNA完整性,通过改良6-羧基二乙酸荧光素/碘化丙啶(6-CFDA/PI)双荧光标记方法检测精子质膜完整性,通过人精子豌豆凝集素(PSA)荧光染色检测精子顶体完整性。3.以20例符合精子库捐精条件的初筛志愿者为研究对象,对照组：0.5 ml精液与0.5 ml生理盐水混合；实验组：0.5 ml精液与0.5 m1雪域圣宝混合,CASA计算加药前、0.5 h、3 h和24 h精子的活动率、平均路径速率VAP、曲线速率VCL和直线速率VSL,0.5 h通过PSA荧光染色对精子顶体状态进行评估,3 h时通过酶联免疫吸附实验(ELISA)对精浆中DNA氧化损伤生物标志物(8-OHdG)含量进行评估,24 h时通过伊红-苯胺黑法对质膜完整性进行评估。结果：1A、B、C、D组H19基因ICR区的DNA甲基化率以克隆数计算时分别为58.70%、53.85%、49.46%和45.74%,以CpG岛数计算时分别为97.57%、97.33%、97.13%和96.56%,两者都有降低趋势,但组间差异均无统计学意义(P0.05)；四组MEST基因ICR区甲基化率以克隆数计算时分别为41.10%、45.33%、47.30%和50.68%,以CpG岛数计算甲基化率时分别为1.77%、1.74%、2.00%和2.26%,有升高趋势,但差异亦无统计学意义(P0.05)。2.冷冻7d的实验组DNA完整率为(74±4.64)%,与未冷冻对照组(80±5.42)%相比,差异有统计学意义(P0.05)；实验组膜完整率为(68±6.23)%,与对照组(75±5.82)%相比,差异有统计学意义(P0.05)；实验组顶体完整率为(77±6.13)%,与对照组(82±5.71)%相比,差异亦有统计学意义(P0.05)。3.实验组不同时点CASA分析精子活动率、VAP、VCL和VSL结果,与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)；实验组0.5 h顶体完整率、3 h精浆中8-OhDG含量及24 h质膜完整性,与对照组相比,差异亦均有统计学意义(P0.05)。结论：1.常规精液冷冻复苏技术对父源印记基因H19及母源印记基因MEST的ICR区甲基化程度未见明显影响,精子冷冻技术在DNA甲基化方面是安全的。2.常规精液冷冻复苏技术对精子结构方面,如对DNA完整性、膜完整性及顶体反应发生率产生较明显影响。3.样品“雪域圣宝”对人类精子影响体外实验的效果显示：未见有明显保护或促进作用。
【关键词】：精液冷冻 DNA甲基化 核DNA完整性 膜完整性 顶体完整性
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-12
• 参考文献10-12
• 第一部分：冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化影响的研究12-31
• 1. 实验材料12-14
• 1.1 主要仪器12-13
• 1.2 主要试剂13-14
• 1.3 主要溶液14
• 2. 实验方法14-21
• 2.1 标本采集与分组14-15
• 2.2 精液冷冻复苏15-16
• 2.3 精子DNA提取16
• 2.4 亚硫酸氢盐处理16-18
• 2.5 目的片段扩X，
  
  本文编号：373390
  suoshi