间日疟原虫DNA文库的构建和克隆筛选及其用于疟疾基因诊断的研究

发布时间：2024-11-27 21:39

　　疟疾广泛流行、严重危害人类的健康，每年全球发病人数达亿之多，其中我国有数拾万，主要是间日疟。敏感特异的疟疾诊新和有效的流行病学监测是疟疾防治的必要前提。长期以来，疟疾的诊断依赖于涂血片镜捡的方法，费时费力，不适用于大样本的流行病学调查。免疫学方法的特异性和稳定性较差，尤其不能鉴别有疟史的和现症患者，使其应用受到限制。 基因工程技术的问世有力地推动了疟疾诊断技术的发展，用疟原虫DNA探针作疟疾的基因诊断，具有高度的敏感性和特异性，尤其适用于疟疾流行病学调查和疟原虫分子水平上的种株分类。疟原虫DNA探针的来源主要有三种：基因组DNA，重组质粒和合成的寡核苷酸片段。其中，前者的特异性差，后者的成本高，重组质粒DNA最为适用。目前，在疟疾基因诊断的研究中，由于取材困难，研制间日疟原虫(Plasmodium vivax，Pv)DNA探针的报道极少，恶性疟

【文章页数】：76 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
英文缩写词表
中文摘要
英文摘要
文献回顾
    一、疟原虫DNA文库构建的研究概况
        (一) 疟原虫基因组的特征
        (二) 目的DNA的制备和载体的选择
        (三) 疟原虫基因的克隆与筛选
        (四) 疟原虫特异性DNA片段的筛选
    二、疟原虫核酸探针的制备与应用
        (一) 疟原虫核酸探针的制备
        (二) 用核酸探针诊断疟疾
        (三) 用核酸探针鉴别疟原虫株
前言
第一部分 间日疟原虫DNA文厍的构建及克隆筛选
    实验材料
    实验方法
        (一) 间日疟原虫的采集与分离
        (二) 间日疟原虫基因组DNA的提取
        (三) 质粒DNA的提取
        (四) 质粒DNA的纯化
        (五) DNA琼脂糖凝胶电泳
        (六) 间日疟原虫基因组DNA的部分酶切
        (七) 质粒DNA的酶切与制备
        (八) DNA酶切片段的回收
        (九) 质粒线性载体的去磷酸化
        (十) 感受态细胞的制备
        (十一) DNA的连接和转化
        (十二) ³²P-DNA探针的制备
        (十三) 菌落原位杂交
    实验结果
        (一) 间日疟原虫的分离及其DNA提取
        (二) 质粒DNA的提取和酶切
        (三) 间日疟原虫基因组DNA的部分酶切和克隆
        (四) 间日疟原虫DNA克隆的筛选
    讨论
第二部分 间日疟原虫DNA克隆的鉴定与分析
    材料和方法
        (一) 实验材料
        (二) 细菌培养
        (三) 质粒DNA的提取和酶切鉴定
        (四) M₁₃噬菌体双链DNA的制备
        (五) M₁₃噬菌体的重组与鉴定
        (六) M₁₃噬菌体单链DNA的制备
        (七) Southern blot分析
        (八) DNA序列测定
        (九) DNA序列数据的微机处理
    实验结果
        (一) 间日疟原虫DNA重组质粒的酶切鉴定
        (二) Southern blol分析
        (三) DNA序列分析
    讨论
第三部分 用重组DNA探针检测间日疟原虫
    材料和方法
        (一) 实验材料
        (二) 常规基因工程操作技术
        (三) ³²p标记探针的打点杂交
        (四) 生物素标记探针的制备
        (五) 生物素标记探针的打点杂交
    实验结果
        (一) ³²P标记探针诊断间日疟的反应性
            1、杂交敏感性
            2、杂交特异性
            3、与镜检符合率
        (二) 生物素标记探针检测间日疟原虫的反应性
            1、显色灵敏度
            2、杂交敏感性
            3、杂交特异性
    讨论
总结
致谢
参考文献



本文编号：4012717