Triciribine在dHL-60细胞极性化中的作用研究

发布时间：2017-07-28 16:13

  本文关键词：Triciribine在dHL-60细胞极性化中的作用研究

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【摘要】：研究背景急性或化脓性感染、中毒、恶性肿瘤、组织损伤等病理生理过程,均与嗜中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMNs)的定向迁移有关,而中性粒细胞的定向迁移与其极性和趋化性关系密切。中性粒细胞能够感知前后端不超过2%的趋化物浓度差异,进而通过信号放大效应在细胞内部激活大量的信号分子,引起蛋白和细胞器的重新分布,特别是F-actin和Myosin等细胞骨架的重构。最终导致细胞形状的变化,形成头部宽钝的片足和尾部窄长的尾足,即为中性粒细胞的极性化。正是在此基础上,通过片足的不断前伸和尾足与基质的不断黏连和解离,中性粒细胞能够穿越血管壁,向感染位置迁移和募集,即为细胞的趋化效应。常见的趋化物有来自细菌的多肽甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(fMLP)、白细胞介素8(IL-8)和补体成分c5a等,其中fMLP作用最强。Akt是分子量大约为60kD的丝/苏氨酸蛋白激酶,约由480个氨基酸残基组成,结构上分为N端(PH结构域)、中心催化结构域和C端(与PK调节区类似的区域)。Akt具有三种异构体：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ。磷酸化是Akt激活的主要机制,其调节主要依赖于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)信号通路。Akt有两个磷酸化位点,分别位于催化域和调节域,即Thr308和Ser473,其完全激活需要两个位点都被磷酸化。小G蛋白,因分子量只有20～30KD而得名,由于具有GTP酶活性,能在多种细胞反应中充当开关的作用。小G蛋白的共同特点是,当结合了GTP后即成为可活化下游分子的活化状态,而当GTP被其自身水解为GDP时则恢复到非活化状态。我们实验涉及的小G蛋白主要是Rho家族,包括Racl、Rac2、Cdc42和rhoA等。其在细胞骨架网络的构成过程中发挥着调节作用,能调节胞浆中微丝肌动蛋白的聚合或解聚,从而影响细胞形态。已知,PI3K/Akt是中性粒细胞极性化过程中F-actin等聚合和解聚推动片足和尾足形成所谓正反馈环的基础,通过PI2k/Akt和Rho家族的小G蛋白的相互加强作用,形成朝向趋化物高浓度的前后极细胞轴。PI3K/Akt还可通过抑制包括Bad等凋亡基因的产生,进而在细胞凋亡的发生与调控过程中发挥重要的生物学功能。多数肿瘤都伴随有Akt丰度的增高,持续的Akt磷酸化活性增高与人类肿瘤发生、生长、迁移、浸润关系密切,也是化疗药物疗效不佳的一个重要原因。曲西立滨(Triciribine, TCN)是DNA合成抑制剂,能抑制Akt活性,具有广谱抗肿瘤细胞增殖作用。目前已有文献证实,在急性髓性白血病治疗,TCN已经进入到Ⅰ/Ⅱ期的临床研究,但TCN对从早幼粒白血病细胞(HL-60)诱导分化成的类中性粒细胞(dHL-60)极性化和凋亡的影响及机制,目前仍缺乏相关研究支持。目的本研究旨在先后通过不同浓度TCN和均匀浓度的fMLP分别处理dHL-60细胞,观察不同浓度TCN作用于Akt/Rho GTPases通路对dHL-60细胞极性化的抑制作用；并通过流式细胞技术、Western blot和GST pull-down等方法,分别检测不同浓度TCN对dHL-60的细胞凋亡以及Akt和小G蛋白活性的影响。方法1.复苏后经传2代的HL-60细胞,培养到细胞对数生长期,收集1.5×105个HL-60细胞置于15ml含1.25%DMSO的诱导分化液中,在37℃、含5%CO2的孵育箱进行培养诱导分化4d,进行下一步的实验。2.用Zigmond小室建立fMLP浓度梯度为0-100nM,在此浓度梯度下,观察不同浓度TCN预处理dHL-60细胞所引起的定向极性化表现的改变。3.采用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察5μMTCN对均匀浓度fMLP刺激的F-actin极性分布的影响。4.用GST-pull down方法检测TCN对均匀浓度fMLP诱导Cdc42,Rac2活化的影响。5.用流式细胞仪检测不同浓度TCN (0、5、60、80μM)诱导dHL-60细胞的凋亡率。6.用western blot检测不同浓度TCN (0、O.1、1、 5、10、 20、40、60、80、100μM)预处理dHL-60细胞后对均匀浓度fMLP诱导的Akt磷酸化活性的影响。并针对5μM和60μMTCN,在不同时间点(0、15、30、60 min)及有和无均匀浓度fMLP处理的条件下,分别探究其对dHL-60细胞Akt磷酸化活性的影响。7.采用细胞免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察5μM浓度的TCN预处理对Akt向膜上募集的影响。8.实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示,数据用SPSS13.0进行统计分析多组间比较采用完全随机设计方差分析(one-way ANOVA)分析。多组间的两两比较时先采用Homogeneity-of-variance test检验方差齐性,若方差齐(P0.05)采用LSD法,若方差不齐(P0.05)则采用Dunnett, T3法。P0.05为差异有统计学意义。结果1.与对照组相比,经fMLP刺激后的dHL-60细胞极性化率显著升高,TCN预处理dHL-60细胞后,与未预处理组相比,fMLP刺激的细胞极性化率随着TCN浓度升高而降低。当TCN浓度为5μM时,与单独fMLP刺激组相比,细胞极性化显著减弱,尾足也明显变短,且极性化方向不定。TCN升高到10μM时,dHL-60细胞尾足消失,极性化不明显。2.静息状态下,F-actin均匀分布在胞质膜上。用均一浓度为100nM的fMLP刺激5min后,dHL-60细胞发生明显的极性形态变化,F-actin呈极性分布在质膜上,聚集在细胞的片足或伪足上,且荧光增强；用TCN预处理1h后则明显抑制了fMLP所刺激的F-actin极性分布,同细胞静息状态下的表现相似。3.与对照组相比,经fMLP刺激的dHL-60细胞的Cdc42, Rac2活化水平显著性上调,用5μM TCN预处理dHL-60细胞1h后,与未预处理组相比,fMLP刺激引起的Rac2, Cdc42的活化水平显著降低。4.不同浓度TCN (0、5、60、80μM)预处理dHL-60细胞1h后,流式细胞仪检测证实细胞凋亡率随着TCN浓度升高也升高。5.单独fMLP作用可引起Akt在T308和S473两个磷酸化位点均出现明显的磷酸化,在5μM TCN预处理dHL-60细胞1h后Akt磷酸化开始被明显抑制,且随着TCN浓度提高,抑制效果越来越明显。考虑到药物可能的毒副作用,选TCN作为后续实验的TCN浓度。用TCN预处理dHL-60细胞不同时间点(0、 15、30、60 min),再经fMLP刺激,dHL-60细胞Akt的T308和S473位点磷酸化水平随TCN作用时间延长而降低。6.细胞免疫荧光结果显示：经fMLP刺激的dHL-60细胞Akt向膜上募集,而予5μM TCN预处理可以阻止Akt向膜上的募集。结论低浓度TCN可经Akt/Rho GTPases通路参与抑制dHL-60细胞极性化,高浓度TCN促进dHL-60细胞凋亡。
【关键词】：Triciribine 细胞极性化 Akt
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-20
• 材料和方法20-33
• 1 实验材料20-25
• 1.1 细胞培养20
• 1.2 主要试剂20-21
• 1.3 实验仪器21-22
• 1.4 主要溶液的配制22-25
• 2 实验方法25-32
• 2.1 HL-60细胞的培养及诱导分化25
• 2.2 人中性粒细胞分离25-26
• 2.3 细胞极性实验26-27
• 2.4 dHL-60细胞内F-actin的免疫荧光测定27
• 2.5 流式细胞仪测定dHL-60细胞的凋亡率27-28
• 2.6 GST pull down操作步骤28
• 2.7 蛋白免疫印迹实验28-32
• 3 结果分析32-33
• 结果33-44
• 1. DMSO诱导HL-60细胞分化为dHL-60细胞33
• 2. TCN抑制fMLP诱导的dHL-60细胞的极性化33-36
• 3. TCN对人中性粒细胞的极性化影响36-37
• 4. TCN对dHL-60细胞内聚合F-actin的影响37-38
• 5. TCN通过对细胞内活化Rac2和Cdc42蛋白的影响而抑制dHL-60细胞极性化38-39
• 6. 60-80μM TCN增加dHL-60细胞的凋亡39-41
• 7. TCN的不同量效关系与其抑制Akt磷酸化程度不同有关41-42
• 8. TCN抑制Akt向膜上的募集42-44
• 讨论44-48
• 1. TCN在调节dHL-60细胞极性中的作用44-45
• 2. TCN在dHL-60细胞凋亡过程中的作用45-46
• 3. TCN在抗肿瘤研究中的作用46-48
• 全文小结48-49
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 硕士期间发表论文55-56
• 英文缩略词表56-58

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李欣;;PDK1结构与功能研究进展[J];攀枝花学院学报;2014年02期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 叶艳;组蛋白低乙酰化下调PIB5PA表达在人黑色素瘤发生和发展中的作用及其分子机制[D];安徽医科大学;2013年

2 宫晨;LY294002对人骨肉瘤类肿瘤干细胞的影响及其作用机制[D];华中科技大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 陈一飞;乳腺癌中AKT和pAKT蛋白表达的临床意义[D];第二军医大学;2013年

2 葛燕梅;SHIP2对胃癌细胞生长和凋亡的影响以及增强胃癌细胞对紫杉醇敏感性的研究[D];安徽医科大学;2014年

3 李婷;骨髓间充质干细胞对脑缺血大鼠轴突生长及AKT/GSK-3β/CRMP-2表达的影响[D];福建医科大学;2014年

4 朱曼玲;鸡朊蛋白调节DF-1细胞活性的初步研究[D];甘肃农业大学;2014年

5 吴沁璇;六味地黄汤水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠肝脏PI3K/Akt信号通路的影响[D];湖南中医药大学;2015年

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本文编号：584888