环鸟苷酸（cGMP）兔单抗的制备及竞争ELISA测定方法的建立

发布时间：2017-08-07 07:04

  本文关键词：环鸟苷酸（cGMP）兔单抗的制备及竞争ELISA测定方法的建立

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【摘要】：环鸟苷酸(Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate, cGMP)和环腺苷酸(Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, cAMP)是细胞内的第二信使,是原核生物和真核生物中重要的信号通路分子。cGMP对细胞内多种代谢途径产生影响。cGMP可以降低心肌代谢,收缩力和功能,参与干细胞的增殖与分化,抑制糖异生以及兴奋副交感神经。cGMP对视觉信号传导、平滑肌和骨骼肌、神经系统功能、血小板活化、骨生长等的调节起到非常重要的作用。20世纪70-80年代,竞争性蛋白质结合分析法和放射性免疫分析法是检测cGMP的主要方式。但由于放射性免疫分析法对人体有潜在危害,目前已逐步被以兔多抗或鼠单克隆抗体为关键试剂的酶标记法和荧光ELISA法取代。多克隆抗体制备的ELISA试剂盒具有批次间差异大和特异性差的问题,鼠单克隆抗体制备的ELISA试剂盒无上述缺点,但不同cGMP浓度间的吸光度值相差非常小,使用者难以得到可重复性的检测数据。本研究采用SMCC等偶联剂将cGMP偶联于载体匙孔血蓝蛋白(KLH),形成结合抗原cGMP-KLH。通过ELISA方法进行偶联鉴定,确认cGMP已经连接到载体蛋白上。用cGMP-KLH作为免疫原免疫新西兰白兔。将兔子脾细胞与240E骨髓瘤样细胞株融合,得到能够分泌cGMP抗体的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法,选取特异性最好的克隆进行亚克隆并扩大培养,收集上清并采用Protein A亲和柱纯化。采用OD280以及fortebio两种方法测定纯化后的兔单抗IgG浓度。分别采用直接ELISA和竞争ELISA法测定抗cGMP兔单抗的效价和特异性。通过检测抗cGMP兔单抗与载体蛋白(BSA、KLH)的反应,显示cGMP兔单抗不识别载体蛋白。所制备的cGMP兔单抗的效价为3.1 ng/mL,50%抑制浓度(IC50)为12.57 ng/mL。检测抗cGMP兔单抗与cAMP、环磷酸肌苷(cIMP)、环单磷酸胞苷(cCMP)、单磷酸腺苷(AMP)、腺苷-5’-二磷酸(ADP)、5’-三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷-5’-单磷酸(GMP)、5’-鸟苷二磷酸(GDP)、5’-三磷酸鸟苷(GTP)的交叉反应性,根据交叉反应率(Cross reaction,CR)判定cGMP兔单抗对cIMP有33.1%交叉反应性,与其他结构类似物交叉反应率均小于1.2%。说明cGMP兔单抗具有很高的特异性。对相关条件进行优化,得到竞争ELISA最佳反应条件为：cGMP兔单抗最佳工作浓度为0.2μg/mL;cGMP-HRP的最佳的工作浓度为1：100稀释。应用竞争ELISA方法建立了检测cGMP的标准曲线,其检测范围为1.95-120 ng/mL,最低检测限为1.95 ng/mL,回收率为89%-103%,批次内和批次间的精密度分别小于11.68%和13.85%。
【关键词】：cGMP 单克隆抗体 酶联免疫吸附测定 兔
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 致谢4-5
• 主要缩略词5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-14
• 第1章 绪论14-23
• 1.1. 环鸟苷酸的研究进展14-21
• 1.1.1 CGMP的结构14-15
• 1.1.2 CGMP的产生与分解15-17
• 1.1.3 CGMP信号通路的作用机制17-19
• 1.1.3.1 激活蛋白激酶G(PKG)18
• 1.1.3.2 调控CNG离子通道18-19
• 1.1.3.3 调节磷酸二酯酶(PDEs)活性19
• 1.1.4 CGMP调节的生理功能19-21
• 1.1.4.1 CGMP在视觉信号转导中的作用19-20
• 1.1.4.2 NO/CGMP/PKG信号通路调节血管平滑肌舒张20
• 1.1.4.3 CGMP对神经系统功能的调节20
• 1.1.4.4 CGMP信号调节的生理过程——肠分泌、肾素释放与骨生长20-21
• 1.1.4.5 生殖作用21
• 1.1.4.6 癌症21
• 1.1.4.7 NO-CGMP与细胞分化21
• 1.2. CGMP检测方法的研究进展21-22
• 1.3. 本课题的研究内容22-23
• 第2章 CGMP免疫抗原的制备与鉴定23-30
• 2.1 材料与方法23-28
• 2.1.1 材料与设备23-24
• 2.1.1.1 主要仪器设备23-24
• 2.1.1.2 主要试剂及配制24
• 2.1.2 方法24-28
• 2.1.2.1 EDC方法制备CGMP-KLH24
• 2.1.2.2 SMCC法制备CGMP-KLH24-25
• 2.1.2.3 SPDP法制备CGMP-KLH25-26
• 2.1.2.4 CGMP-KLH浓度的测定26-27
• 2.1.2.5 CGMP-KLH免疫抗原的鉴定27-28
• 2.2 结果28
• 2.3 本章小结28-30
• 第3章 抗CGMP单克隆抗体的制备及鉴定30-43
• 3.1 材料和方法30-36
• 3.1.1 实验材料与设备30
• 3.1.2 设备30-31
• 3.1.3 方法31-36
• 3.1.3.1 免疫兔子31-32
• 3.1.3.1.1 抗血清效价测定31-32
• 3.1.3.2 抗CGMP兔单抗的制备及鉴定32-36
• 3.1.3.2.1 抗CGMP兔单抗杂交瘤细胞的制备32-33
• 3.1.3.2.2 抗CGMP兔单抗大转生产以及纯化33-34
• 3.1.3.2.3 CGMP兔单抗的IGG含量测定34
• 3.1.3.2.4 CGMP兔单抗效价测定34-35
• 3.1.3.2.5 CGMP兔单抗与载体蛋白的交叉测定35-36
• 3.2 结果36-41
• 3.2.1 抗血清效价测定结果36
• 3.2.2 间接ELISA在融合阶段的筛选结果36-37
• 3.2.3 间接竞争ELISA测定克隆对CGMP的竞争抑制率37-38
• 3.2.4 间接竞争ELISA测定克隆的特异性38
• 3.2.5 CGMP兔单抗的IGG含量测定结果38-39
• 3.2.6 CGMP兔单抗抗体效价39-40
• 3.2.7 针对载体蛋白的交叉反应40
• 3.2.8 CGMP兔单抗抗体特异性检测40-41
• 3.3 本章小结41-43
• 第4章 CGMP竞争ELISA方法的建立及初步应用43-50
• 4.1 材料和方法43-45
• 4.1.1 实验材料与设备43-44
• 4.1.1.1 主要试剂43
• 4.1.1.2 设备43-44
• 4.1.2 方法44-45
• 4.1.2.1 竞争ELISA条件的优化44
• 4.1.2.2 标准曲线的建立以及灵敏度的确定44-45
• 4.1.2.3 检测回收率45
• 4.1.2.4 验证精密度45
• 4.1.2.5 CGMP兔单抗竞争ELISA检测方法用于样本分析45
• 4.2 结果45-49
• 4.2.1 竞争ELISA优化结果45-46
• 4.2.2 检测标准曲线46-47
• 4.2.3 回收率47-48
• 4.2.4 方法的精密度48
• 4.2.5 CGMP兔单抗竞争ELISA检测方法用于样本分析48-49
• 4.3 本章小结49-50
• 第5章 结论和讨论50-54
• 5.1 抗原制备50-51
• 5.2 兔单抗的优点51
• 5.3 兔单抗的特异性和效价51-52
• 5.4 该方法的验证52-54
• 参考文献54-61
• 个人简历61

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