结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hspl6.3纳米金生物传感器诊断结核病的研究

发布时间：2017-10-22 21:29

  本文关键词：结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hspl6.3纳米金生物传感器诊断结核病的研究

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【摘要】：目的：克隆并表达结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,分析其诊断结核病的价值；并建立基于重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3诊断结核病的纳米金生物传感器,为结核病的血清学诊断提供新的实验依据和技术支持。方法：(1)根据GenBank中结核分枝杆菌TB10.4、Hsp16.3的基因序列设计并合成引物,以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模版,聚合酶链反应(PCR)扩增TB10.4和Hsp16.3的基因片段,重叠延伸PCR技术扩增融合基因TB10.4-Hsp16.3,克隆至pMD18-T载体,菌落PCR和测序鉴定,将序列正确的融合基因TB10.4-Hsp16.3亚克隆至表达载体pET28a(+), PCR和双酶切鉴定阳性重组子。(2)将重组DNA转化E.coli BL21,筛选阳性菌株,异丙基p-D-硫代半乳糖苷诱导表达融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,超声裂解菌体,对包涵体进行变性溶解和复性,His-bindTM柱层析(Ni2+-NTA)纯化重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3, Western blot分析其免疫学活性,ELISA评价其诊断结核病的价值。(3)晶种成长法制备金纳米棒,经MUA、EDC、NHS化学修饰后,与融合蛋白TB10.4-Hsp16.3连接,构建纳米金生物传感器,评价其对结核病的诊断价值。结果：(1)成功获得约750bp的融合基因TB10.4-Hsp16.3,构建了融合蛋白的重组表达质粒pET-TB10.4-Hsp16.3。(2)表达、纯化获得分子量约29kDa的融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,能被结核病患者血清特异识别；其ELISA诊断结核病的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率依次为89.3%、90.7%、90.9%、89.1%、90.0%。(3)构建了基于融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的纳米金生物传感器,其诊断结核病的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率分别为83.9%、85.2%、85.5%、83.6%、84.5%。结论：(1)采用重组DNA技术获得了结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3。(2)融合蛋白TB10.4-Hsp16.3具有良好的免疫活性,可用于结核病的诊断。(3)基于融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的纳米金生物传感器对结核病具有较好的诊断价值。
【关键词】：结核分枝杆菌 融合蛋白 纳米金生物传感器 诊断 结核病
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R52;TP212.3
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 引言11-13
• 2. 材料与方法13-33
• 2.1 菌种和血清13
• 2.2 试剂13-15
• 2.3 主要仪器15-16
• 2.4 主要溶液的配制16-23
• 2.5 方法23-33
• 3. 结果33-43
• 3.1 融合基因TB10.4-Hsp16.3的扩增33
• 3.2 融合基因TB10.4-Hsp16.3的克隆与鉴定33-34
• 3.3 重组TB10.4-Hsp16.3表达载体的构建34-35
• 3.4 重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的诱导表达35
• 3.5 重组融合蛋白TB 10.4-Hsp16.3的纯化35
• 3.6 重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的免疫活性分析35-36
• 3.7 重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的蛋白含量测定36
• 3.8 棋盘滴定法确定包被抗原-抗体最佳工作浓度36-37
• 3.9 重组TB10.4-Hsp16.3的ELISA检测结核病人血清抗体37-38
• 3.10 金纳米棒的制备38
• 3.11 金纳米棒表面的抗原修饰38-39
• 3.12 纳米金生物传感器的血清学检测39-40
• 3.13 TB10.4-Hsp16.3的ELISA和纳米金生物传感器检测结果比较40-43
• 4. 讨论43-49
• 5. 结论49-51
• 参考文献51-57
• 综述57-73
• 参考文献66-73
• 中英文缩略对照表73-75
• 附录75-77
• 致谢77-79

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本文编号：1080219