SAMHD1抗乙肝病毒作用及IFN-α调控SAMHD1表达的机制研究

发布时间：2017-11-12 00:24

  本文关键词：SAMHD1抗乙肝病毒作用及IFN-α调控SAMHD1表达的机制研究

  更多相关文章： SAMHD1 HBV IFN-α 肝细胞 ISGF3

【摘要】：研究背景及目的SAMHD1(the sterile alpha motif and HD domain containing protein-1)2011年被发现是一个新的固有免疫抗病毒分子。SAMHD1通过降解宿主细胞内d NTPs至低水平使逆转录病毒c DNA不能合成进而抑制病毒复制。研究表明SAMHD1可以抑制逆转录病毒、DNA病毒的复制和内源性逆转录因子的逆转录转座。而Ⅱ型艾滋病病毒(HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)辅助基因编码的Vpx蛋白则能拮抗SAMHD1对病毒复制的抑制作用。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是全球性的公共健康问题。我们国家是乙肝病毒感染高度流行的国家。乙肝病毒的生命周期过程中有一个与慢病毒类似的逆转录过程,然而SAMHD1是否可以在肝细胞中通过降解d NTPs来抑制HBV的复制尚不清楚。干扰素(Interferon,IFN)作为乙肝治疗中一种常用的抗病毒药物,可以诱导许多抗病毒蛋白表达从而抑制病毒的复制。IFN-α可以通过经典途径和非经典途径诱导基因表达。经典IFN-α信号通路通过干扰素刺激基因因子3(ISGF3)诱导基因表达。ISGF3包括STAT1、STAT2和IRF9。非经典信号通路是STAT1非依赖的。至今,IFN-α在肝细胞中调控SAMHD1表达的机制尚不明确。本研究将探讨SAMHD1对HBV复制的影响及IFN-α以何种途径诱导肝细胞中SAMHD1表达。方法选取肝细胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721,使用Western Blot检测SAMHD1内源性表达水平,并用免疫荧光法验证。选择两株低表达SAMHD1的肝细胞BEL-7402和SMMC-7721,分别转染p SAMHD1wt和p SAMHD1HD/AA,MTT检测细胞的活性率。p HBVwt分别与p SAMHD1wt或p SAMHD1HD/AA瞬时转染入SMMC-7721和BEL-7402细胞,Western Blot检测SAMHD1外源性表达情况。p HBVwt,p RL-TK分别与p SAMHD1wt或p SAMHD1 HD/AA共转染SMMC-7721和BEL-7402细胞,48 h后,ELISA检测细胞上清HBs Ag、HBe Ag含量,q RT-PCR检测HBV核心相关DNA的水平。Hep G2细胞转染p HBVwt和p HBV△X质粒,Western Blot检测SAMHD1蛋白表达水平。选取SMMC-7721和BEL-7402细胞,IFN-α以不同剂量和时间点处理肝细胞后,Western Blot和q RT-PCR检测SAMHD1表达改变情况。选取IFN-α诱导的SMMC-7721细胞,分别转染STAT1、STAT2和IRF9 si RNA下调相应基因表达后,再用IFN-α刺激,Western Blot和q RT-PCR检测IFN-α诱导SAMHD1表达是否受到抑制。结果在四株肝细胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721中,检测到SAMHD1均有内源性表达;SAMHD1的外源性表达对肝细胞系无细胞毒作用;肝细胞SMMC-7721、BEL-7402中SAMHD1可以抑制HBV的复制;Hep G2细胞中HBV复制可以下调SAMHD1表达;在肝细胞SMMC-7721、BEL-7402中IFN-α以时间和剂量依赖的方式上调SAMHD1蛋白表达水平;IFN-α处理的SMMC-7721细胞以时间依赖的方式在m RNA水平上调SAMHD1表达;分别用特异性si RNAs下调STAT1、STAT2和IRF9基因表达后,SMMC-7721细胞中再加入IFN-α刺激10 h,IFN-α诱导的SAMHD1表达水平下降。结论1.SAMHD1在肝细胞内可以抑制HBV复制;2.IFN-α在肝细胞中可以诱导SAMHD1表达;3.IFN-α在SMMC-7721中通过ISGF3复合体诱导SAMHD1表达。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62

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本文编号：1173553