探索分枝杆菌噬菌体应用于结核病治疗的潜力

发布时间：2018-02-21 10:52

  本文关键词： 分枝杆菌噬菌体 裂解 结核分枝杆菌 结核休眠菌 复苏　出处：《重庆医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的 目前结核病疫情仍相当严峻，化疗疗程过长和结核菌耐药是当前急待解决的两大主要难题。国内外研究发现部分分枝杆菌噬菌体能有效裂解结核菌标准株，甚至耐药的结核菌，而鸡尾酒制剂抗结核的效果更好，还能延缓结核菌对噬菌体产生抗性。同时也有研究发现尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝杆菌噬菌体能有效感染静止期的耻垢分枝杆菌，且motif3具有复苏促进因子类似的水解肽聚糖的作用。故本实验首先是继续筛选能作为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂配方的噬菌体，同时也进一步明确尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝杆菌噬菌体能否复苏休眠的结核菌。 方法 1分枝杆菌噬菌体Bo4抗结核潜力研究 1.1分枝杆菌噬菌体Bo4裂解不同pH值7H9固体培养基上耻垢分枝杆菌mc2155能力的比较。 1.2体外研究分枝杆菌噬菌体Bo4阻止结核菌生长的能力，结果使用统计软件SPSS17.0进行统计分析。 2分枝杆菌噬菌体Bo4基因组生物信息学分析 2.1采用EditSeq软件分析基因组的一般特点：①应用DNAStar软件包中Editseq分析基因组大小及GC含量。②应用TRF软件推测Bo4基因组中可能的串联重复序列。③应用tRNAscan软件预测Bo4基因组中可能的tRNA区域。 2.2采用Glimmer3.0软件进行基因预测，预测分枝杆菌噬菌体Bo4的编码区域。 2.3将分枝杆菌噬菌体Bo4核苷酸序列与数据库的核苷酸序列做Blast分析对比，并将分析对比最好的结果制作成点阵图。 2.4将分枝杆菌噬菌体Bo4基因与数据库基因进行Blast m8比对，将比较的最好结果生成svg的共线性图。 2.5分枝杆菌噬菌体Bo4与其他6株G簇分枝杆菌噬菌体序列两两比对，采用邻接法，最后用tree view软件生成进化树图。 3分枝杆菌噬菌体TM4促使结核休眠菌复苏的初步探索 3.1采用密闭培养对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv构建结核休眠菌模型。 3.2采用药敏检测、直接培养法和电镜观察作为结核休眠菌模型的检测方法。 3.3采用双层固体培养基法扩增分枝杆菌噬菌体TM4及采用小平板法测定噬菌体TM4滴度。 3.3采用肉眼观察、菌落计数和电镜观察作为结核休眠菌复苏的检测指标。 结果 1分枝杆菌噬菌体Bo4抗结核潜力研究 1.1分枝杆菌噬菌体Bo4裂解不同pH值7H9固体培养基上耻垢分枝杆菌mc2155能力的比较。 1.2分枝杆菌噬菌体Bo4感染组与空白对照组比较，，在分别培养1天、3天及5天后，两组结核菌量均有明显差异，说明分枝杆菌噬菌体Bo4能有效裂解结核菌，阻止其生长。 2分枝杆菌噬菌体Bo4基因组生物信息学分析 2.1分枝杆菌噬菌体Bo4基因组大小为39318bp，GC含量为66.76%。通过TRF软件在噬菌体Bo4基因组中未找到串联重复序列。通过tRNAscan软件在噬菌体Bo4基因组中未找到tRNA。 2.2根据Glimmer3.0软件分析，共预测出58个推测基因，对这些基因逐个进行同源检索分析，得到19个已知功能的基因，35个基因与未知功能的基因有同源性，4个基因未找到同源性基因。通过生物学信息分析在分枝杆菌噬菌体Bo4基因组中未发现有毒基因。 2.3分枝杆菌噬菌体Bo4基因组的58个基因中只有4个基因与BPs和Angel无同源性，相似度达93.10%，共线性清晰，所以我们推测Bo4属于G簇分枝杆菌噬菌体，并且基因组是双链线性DNA。 2.4分枝杆菌噬菌体Bo4核苷酸序列与数据库核苷酸序列比较分析发现，其与目前已经测序的6株G簇分枝杆菌噬菌体核苷酸序列相似性均较高（平均相似性90%），也证明分枝杆菌噬菌体Bo4属于G簇分枝杆菌噬菌体。 2.5从系统发育树分析可知距离越近的噬菌体，亲缘关系越近。分枝杆菌噬菌体Bo4与其他6株G簇分枝杆菌噬菌体核苷酸相似性均较高，系统发育学分析发现其与分枝杆菌噬菌体Legendre的关系最近。说明这两株分枝杆菌噬菌体具有共同的祖先。 3分枝杆菌噬菌体TM4促使结核休眠菌复苏的初步探索 3.1结核休眠菌模型的构建及检测 密闭培养18天的含亚甲蓝的结核分枝杆菌标准株H37Rv试管变为无色，说明此时试管已变为缺氧。密闭培养50天还有部分结核菌可培养，未完全进入休眠菌状态。密闭培养93天的模型液接种在罗培养基上无菌落生长。将对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv和密闭培养120天的结核分枝杆菌标准株H37Rv行电镜观察，见密闭培养120天的结核分枝杆菌标准株H37Rv的细胞壁比对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv的细胞壁厚，交联更紧密。 3.2噬菌体液的制备 按照双层固体培养法扩增分枝杆菌噬菌体TM4，直接刮取上层培养基收集噬菌体液及采用小平板法测噬菌体TM4滴度，测定为2.1×1010PFU/mL。 3.3复苏休眠菌 3.3.1肉眼观察培养3天Rpf E组管底菌量多于其余组；培养8天噬菌体TM4组管底菌量多余空白组；后续观察见TM4组及Rpf E组管底菌量较前均有增加，培养上清液明显变黄，空白组与之前比较也稍有增加。 3.3.2混合液培养1天时三组菌落计数均是0CFU/m；培养6天时，空白组、TM4组和Rpf E组的菌落计数分别是0CFU/mL、0.7×102CFU/mL和2×104CFU/mL；培养14天时，空白组、TM4组和Rpf E组的菌落计数分别是3.4×101CFU/mL、1.68×107CFU/mL和2.1×109CFU/mL。 3.3.3电镜观察培养17天混合物TM4组有大量薄壁结核菌、部分厚壁且交联紧密的结核休眠菌和结核菌细胞碎片；Rpf E组满视野薄壁的结核菌；空白组含大量厚壁的结核休眠菌和少数薄壁结核菌。 结论 分枝杆菌噬菌体Bo4能有效阻止体外结核菌的生长，基因组生物信息学分析发现其是一株不含有毒基因的裂解性噬菌体，满足作为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂配方噬菌体的安全性要求。分枝杆菌噬菌体TM4能有效感染结核菌，并且在复苏结核休眠菌的同时随着成熟子代噬菌体的释放，会裂解被感染的结核休眠菌细胞。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52

【参考文献】

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2 彭丽;陈保文;罗永艾;沈小兵;黎友伦;苏城;王国治;;噬菌体D29对耐药结核病豚鼠的治疗作用[J];第四军医大学学报;2009年17期

3 佴静;朱雪薇;刘忠泉;;复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究[J];中国医学工程;2008年02期

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本文编号：1521782