播散性念珠菌病小鼠肾脏中HSP90及TLR4表达及相关性研究

发布时间：2018-03-14 08:04

本文选题：白念珠菌　切入点：免疫组化　出处：《河北医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：播散性念珠菌病发病与机体的天然免疫和特异性免疫有关。尤其是天然免疫在发病中的作用越来越受到重视。TLRs是宿主识别各种病原体相关分子模式,并激活和调节天然免疫-适应性免疫反应的一类模式识别受体。白念珠菌表面的特征性糖磷脂甘露聚糖可被TLR4识别,通过诱导前炎性细胞因子的释放及促进中性粒细胞的聚集等来介导宿主的抗真菌免疫反应。热休克蛋白(Heat shockprotein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质,加热、缺氧、感染、氧化剂等刺激因素都可诱导其表达增加。HSP除参与机体的氧化应激反应外，还参与机体的天然免疫过程。HSP90是近年来研究与白念珠菌感染密切相关的一类分子。有研究显示HSP细胞因子的效应是通过TLR2和TLR4信号途径，导致NF-KB因子和MAPK激酶的激活实现的。本研究通过建立播散性念珠菌病感染小鼠动物模型，探讨HSP90及TLR4在播散性念珠菌病小鼠肾脏的表达及HSP90及TLR4表达的相关性，探讨其在播散性念珠菌病发病的免疫机制，为免疫及生物治疗提供理论依据。方法： 1实验菌株白念珠菌，来源于河北医科大学第二医院皮肤性病科真菌检查室保存菌种。 2建立播散性念珠菌病小鼠模型昆明小鼠90只，清洁级，雌雄各半，5～6周龄,20～25g,由河北医科大学实验动物中心提供。经过适应环境，按体重随机分成A、B、C三组，每组小鼠各30只。A组为实验组：在实验的第1天通过腹腔注射200mg/kg·d环磷酰胺，连续4天，第5天时，经腹腔注射白念珠菌菌悬液0.2mL/只，菌悬液的浓度是1～5×106cfu/mL，共1天。B组环磷酰胺对照组：在实验的第1天经腹腔连续4天注射同等量的环磷酰胺，第5天时，经腹腔注射生理盐水0.2mL/只，共1天。C组空白对照组：在实验第1天经腹腔连续5天注入同等量的生理盐水。分别于实验第6天、第9天、第20天分三批处死小鼠，观察小鼠腹腔内部脏器大体情况。 3鉴定播散性念珠菌感染小鼠肾脏菌株无菌条件下解剖小鼠取出肾脏，用无菌生理盐水冲洗肾脏组织数次，将小鼠1/2肾脏组织研磨，在沙氏培养基上接种培养。 4组织病理学检查和免疫组化检测剩余肾脏组织用10%福尔马林固定，进行常规病理HE染色和PAS染色，观察小鼠肾组织白念珠菌感染情况和病理变化。运用免疫组织化学方法（链霉菌抗生素蛋白--过氧化物酶连接法SP）检测HSP90和TLR4的表达情况。结果： 1建立播散性念珠菌病感染小鼠模型实验过程中，小鼠由于注射环磷酰胺免疫抑制剂造成多个脏器水肿、出血共死亡11只；由于白念珠菌播散感染共死亡12只；不明原因共死亡13只。最后，纳入实验的总计54只小鼠。A组小鼠在实验第6d，饮食和精神稍差，毛发没有光泽，呼吸正常。解剖小鼠见腹腔内部分脏器明显水肿，未见白色脓点形成；实验第9d，解剖小鼠见腹腔内各脏器白色脓点形成；实验第20d，解剖小鼠见腹腔内各脏器大量白色脓点形成，部分脏器充血和坏死。B组小鼠在实验的第6d，食欲和精神稍差，毛发没有光泽，呼吸、活动正常。解剖小鼠见腹腔内部脏器部分充血和水肿；实验第9d，解剖小鼠见腹腔内脏器充血、水肿、坏死、没有白色脓点形成；实验第20d，解剖小鼠见脾脏明显肿大，肝脏略充血，肾脏稍水肿。C组小鼠饮食和精神佳，毛发光泽、无杂乱，呼吸、活动好，于实验第6d、9d、20d解剖小鼠，腹腔内部脏器都表现正常。 2播散性念珠菌感染小鼠肾脏组织真菌的培养和鉴定将A组小鼠第6d、9d、20d的肾脏组织接种于沙氏培养基上培养72h后，可见白色菌落生长，通过血清培养法和厚膜孢子琼脂培养基鉴定为白念珠菌。 3组织病理学观察 A组小鼠，实验第6d，镜下可见完整肾小管、肾小球结构，PAS染色未见紫红色孢子、菌丝；实验第9d，镜下可见肾小管、肾小球结构破坏，细胞核固缩，PAS染色见紫红色孢子、菌丝；实验第20d，肾小管、肾小球结构消失，坏死形成，PAS染色见大量紫红色孢子、菌丝；B组小鼠，实验第6d，9d及20d，肾小管、肾小球结构完整，部分细胞变性，胞浆均质红染，细胞核完整；C组小鼠显微镜下均呈正常表现。 4TLR4在蛋白水平表达情况运用免疫组织化学方法检测小鼠肾脏中的TLR4主要在细胞胞膜中表达，阳性细胞可见胞膜上有棕黄色颗粒沉积。免疫组化染色结果显示，A、B、C三组都显示阳性细胞表达。A组：第6d、第9d、第20d OD值分别为0.1935±0.2019、0.2183±0.0369、0.1991±0.3083，表达呈先上升后下降趋势，P0.05，差异有统计学意义。B组：第6d、第9d、第20d OD值分别为0.1980±0.0290、0.2107±0.0240、0.2100±0.0288，表达呈先上升后下降趋势，P0.05，差异没有统计学意义。C组：第6d、第9d、第20d OD值分别为0.1834±0.0182、0.2017±0.0258、0.1962±0.0232，表达呈先上升后下降趋势，P0.05，差异有统计学意义。实验第6d，A、B、C三组OD值分别为0.1935±0.2019、0.1980±0.0290、0.1834±0.0182，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异无统计学意义，实验第9d，A、B、C三组OD值分别为0.2183±0.0369、0.2107±0.0240、0.2017±0.0258，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异没有统计学意义，实验第20d，A、 B、 C三组OD值分别为0.1991±0.3083、0.2100±0.0288、0.1962±0.0232，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异无统计学意义。进行重复测量设计资料方差分析，其中各组在不同时间点之间存在差别，F=8.093，P0.05，差异有统计学意义，进行总体比较不同组间不存在差别F=3.595，P0.05，差异无统计学意义。 5HSP90在蛋白水平中表达情况运用免疫组织化学方法检测小鼠肾脏中HSP90主要表达于细胞胞浆中，阳性细胞可见胞浆上有棕黄色颗粒沉积；免疫组化结果显示，A、B、C三组都显示阳性细胞表达。A组：实验第6d、第9d、第20dOD值分别为0.1851±0.0201、0.2155±0.0345、0.1894±0.0266，表达先上升后下降趋势， P0.05，差异有统计学意义；B组：实验第6d、第9d、第20d OD值分别为0.1769±0.0183、0.1961±0.0234、0.1924±0.0310，表达先上升后下降趋势, P0.05,差异无统计学意义；C组：实验第6d、第9d、第20d OD值分别为0.1825±0.0300、0.1945±0.0345、0.1925±0.0351，表达先上升后下降趋势，P0.05，差异无统计学意义。实验第6d，A、B、C组OD值分别为0.1851±0.0201、0.1769±0.0183、0.1825±0.0300，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异无统计学意义，实验第9d，A、B、C三组OD值分别为0.2155±0.0345、0.1961±0.0234、0.1945±0.0345，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异无统计学意义，实验第20d，A、B、C三组OD值分别为0.1925±0.0351、0.1924±0.0310、0.1894±0.0266，实验组比空白对照组表达升高，P0.05，差异无统计学意义。通过重复测量资料设计方差分析，各组在不同时间点之间存在差别，F=8.375，P0.05，差异有统计学意义。进行总体比较不同组间不存在差别，F=0.914，P0.05，差异无统计学意义。 6TLR4与HSP90的相关性结果实验组HLR4与HSP90表达的OD值通过曲线拟合，实验第6d得到r=0.002，P0.05，差异无统计学意义，说明二者无明显相关；实验第9d得到，r=0.000，P0.05，说明二者无明显相关；实验第20d得到，r=0.081，P0.05，说明二者无明显相关。结论： 1TLR4在播散性念珠菌病小鼠肾脏组织中的表达，在感染早期呈现上升趋势，到晚期呈现下降趋势。 2HSP90在播散性念珠菌病小鼠肾脏组织中的表达，，在感染早期呈现上升趋势，到晚期呈现下降趋势。 3TLR4与HSP90的表达在感染晚期都呈现下降趋势，有可能是造成白念珠菌侵袭性感染肾脏的病因之一。 4TLR4和HSP90在播散性念珠菌病小鼠肾脏组织的表达比在正常小鼠肾脏表达升高。 5播散性念珠菌病小鼠肾脏中HSP90及TLR4表达无相关性。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R756.5

【参考文献】