新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞诱导单核细胞迁移的研究

发布时间：2018-03-17 00:00

本文选题：新生隐球菌　切入点：HIV-1gp41　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景和目的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,Cn)是一种具有荚膜的酵母型真菌,广泛存在于土壤和鸽粪中,主要感染免疫力低下和免疫缺陷人群,其嗜中枢的治病特性极易引起中枢神经系统感染,尤其以HIV相关性隐球菌脑膜炎最为严重,死亡率极高。因此,作为AIDS最严重的真菌感染并发症,新生隐球菌脑膜炎的研究已成为HIV和真菌研究的热点。新生隐球菌以呼吸道吸入为主要致病途径,通过无症状的肺部感染后穿越肺泡-毛细血管屏障进入血循环播散至其他深部组织,主要是中枢神经系统。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)主要有紧密连接的脑微血管内皮细胞(Brain microvasclar endothelial cell, BMEC)构成,新生隐球菌只有穿透血脑屏障才能引起脑膜炎。我们之前研究了Cn与人脑微血管内皮细胞(Human BMEC)之间的相互作用,新生隐球菌可以诱导HBMEC产生细胞骨架肌动蛋白重排和细胞膜表面的CD44在分配。多糖荚膜是新生隐球菌主要的毒性因子。Ambrose Jong等研究表明,新生隐球菌的CPS1基因编码其透明质酸酶(hyaluronic acid synthase),后者合成透明质酸(hyaluronic acid, HA)。HA可以结合HBMEC表面的主要黏附分子CD44,与新生隐球菌黏附侵袭脑微血管内皮细胞密切相关。HA几乎是所有哺乳动物细胞的胞质成分,还可能参与肿瘤侵袭和转移的生物学过程。目前已经利用染色体同源重组技术,构建了新生隐球菌B4500FO2株的CPS1基因缺失株TYCC645#32和CPS1基因回补株CPIP,不表达HA的TYCC645#32相对于B4500FO2,对脑微血管内皮细胞的粘附侵袭率明显降低,证明HA作为CD44的配体,是粘附侵袭HBMEC的重要毒力因子。脑微血管内皮细胞上有多种HA的受体,如CD44, RHAMM, Ivd4,其中CD44是新生隐球菌HA的最主要受体,主要分布在细胞中的膜脂筏(lipid rafts)上,可以在细胞膜和胞质间流动,这种流动的膜结构可能是其信号转导机制的基础。新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞后,CD44分子再分配于膜脂筏中,由胞质向细胞膜再聚集,经过一系列信号转导使细胞骨架肌动蛋白重排,使新生隐球菌进入宿主细胞。另外,黏附分子CD44表达于多种类型的细胞中,涉及多种细胞的免疫过程,如细胞与基质、细胞与细胞间的黏连和细胞迁移、生存、分化等,是一个分布广泛的细胞表面受体家族。透明质酸(HA)结合区域和一个共同的跨膜结构是CD44的保守区域。研究发现,新生隐球菌CPS1野生株刺激脑微血管内皮细胞CD44过度表达,在结合位点可见大量的CD44。同时,白细胞与内皮细胞相互作用也依赖CD44/HA。单核吞噬系统是免疫反应的第一道防线,单核吞噬细胞可以吞噬杀伤新生隐球菌,但是新生隐球菌依赖多糖荚膜等多种毒力因子可以在吞噬细胞内生存繁殖,特别是HIV感染患者单核吞噬细胞功能失调时就成为隐球菌从血循环向深部组织扩散的工具。目前已有多方面的证据支持存在木马机制的穿血脑屏障模式。动物实验表明,将和单核细胞共孵育的隐球菌注入小鼠后,其脑组织真菌负荷相比单纯注射隐球菌明显增多。HIV-1gp41-I90可以诱导HBMEC膜脂筏和CD44重新分布和高表达,从而促进新生隐球菌对HBMEC的黏附侵袭。趋化迁移实验是一种研究新生隐球菌感染时,单核细胞与脑微血管内皮细胞相互作用和运动的很好的实验方法和手段。实验装置是一种有特定孔径的杯状的膜滤器,将脑微血管内皮细胞铺于膜上以模拟血脑屏障。这种实验手段经常被用于共培养、细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等多方面的研究中。本研究目的将利用人脑微血管内皮细胞(Human brain microvasclar endothelial cell, HBMEC)构建体外血脑屏障模型,通过黏附和趋化迁移实验研究新生隐球菌感染HBMEC对单核细胞的粘附和迁移通过血脑屏障的影响,HIV-1gp41-I90单独作用以及与新生隐球菌协同刺激HBMEC对单核细胞迁移通过血脑屏障的影响；利用体外黏附和趋化迁移实验,对比使用CD44抑制剂和抗体前后,单核细胞迁移的变化,以证明CD44是影响单核细胞迁移的关键分子；利用免疫荧光技术,比较HIV-1gp41-I90和Cn协同作用HBMEC诱导细胞表面CD44表达的情况。二、研究方法 1、单核细胞黏附实验检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的单核细胞粘附情况：实验前24小时用HBMEC铺96孔板106cell/孔,将实验用各菌株真菌以EM培养基稀释为108cfu/ml备用,以下列各种条件刺激单层HBMEC:不同剂量的Gn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同剂量的Cn、HIV-1gp41-190孵育不同时间,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗体,然后加入THP-1孵育1h,显微镜下计数黏附在HBMEC上的THP-1细胞数,计算黏附率。 2、单核细胞趋化迁移实验检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的单核细胞迁情况：将106cell铺于趋化小槽(Millicell,12μm孔径)中培养3-5天,测试TEER值在200-300Ω2·cm2时可以进行趋化实验。以下列各条件刺激趋化槽中的HBMEC:不同剂量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同剂量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育不同时间,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗体,然后加入THP-1孵育3h后计数迁移到下槽液中的细胞数,计算出迁移率。 3、免疫荧光方法检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染后HBMEC的CD44的表达：HBMEC培养在24孔板中,以不同菌量的野生株B4500F02孵育3h以观察不同菌量感染HBMEC对CD44表达的作用；以相同菌量的B4500FO2分别孵育30min、2h和3h以观察不同孵育时间对CD44表达的影响；以0、5×106cfu/mL的B4500FO2、 gp41-19020μg/mL和20μg/mL的gp41协同5×106cfu/mL的Cn分别孵育HBMEC3h,然后免疫荧光染色观察CD44表达的情况。三、结果 1、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的黏附和迁移作用与真菌菌量和感染时间相关以野生株B4500F02不同剂量组(106、5×106和5×107cfu/mL)感染HBMEC诱导THP-1细胞的相对黏附率分别为136±6.7%、165±6.4%和197±9.6%,迁移率分别为28.875±2.21%、29.625±1.15%和36.55±1.95%,与对照组相比有明显差异,P0.05；以野生株B4500F02感染HBMEC不同孵育时间组(1、2和6h)诱导THP-1细胞的相对黏附率分别为165±6.4%、221±9.8%和320±14.7%,不同孵育时间组(1、2、3、6、12和24h)对应迁移率分别为23.42±1.39%、27.925±0.34%、29.625±1.15%、39.575±3.55%、45.055±6.11%和50.77±2.83%,与对照组相比3h组有差异,P0.05,6-24h组差异明显,P0.01。 2、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用可被CD44阻断剂Bikunin和抗体不同程度的阻断应用不同浓度阻断剂Bikunin(0.1nM、1nM、5nM和20nM)后相对黏附率分别为82±4%、48±3.4%、37±3.4%和30±3.9%,迁移率为21.625±1.22%、19.45±2.22%、13.675±0.64%和12.725±1.61；应用不同浓度的anti-CD44抗体(10ng、100ng、500ng和1000ng)后相对黏附率分别为91±3.6%、77±3.3%、58±4.5%和32±3.9%,迁移率分别为21.775±1.86%、21.775±1.86%、13.875±1.99%和10.075±1.15%,各组与PBS对照组比较有明显差异,P0.01。 3、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用与荚膜HA有关利用HA的野生株、缺失株和回补株Cn分别感染内皮细胞诱导的THP-1相对黏附率分别为165±6.3%、126±5.8%和158±6.9%,野生株相比对照组、缺失株均有显著差别,P0.01；迁移率分别为30.575±1.99%、23.85±1.79%和26.825±1.67%,野生株相比对照组有显著差异,P0.01,野生株相比HA缺失株差异明显,P0.05。 4、新生隐球菌数量和感染时间影响HBMEC细胞上CD44的表达利用荧光标记抗体检测技术,我们发现随真菌浓度和孵育时间的增加,细胞膜上CD44表达增强,且信号向细胞膜集中。不同的孵育时间对CD44的表达也有很大影响,相比对照组,孵育2h和3h组的荧光信号变得更强,且向细胞膜集中。 5、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用与其剂量和孵育时间相关和HBMEC一同孵育的HIV-1gp41-I90浓度的增加及孵育时间的延长可以促进THP-1黏附和迁移。HIV-1gp41-I90的四个浓度组(0.2、2、20和200μg/mL)诱导THP-1的相对黏附率分别是107±0.5%、117.5±9.5%、150±2.6%和235±15%,当浓度达到2μg/mL时,相比对照组相对黏附率有明显差异,P0.05,浓度达到20-200μg/mL时,相对黏附率相比对照组有显著差异,P0.01；迁移率分别是21.575±4.47%、24.483±3.16%、29.05±3.48%和30.6±3.97%,与对照组比较,浓度在20-200μg/mL时有明显差异,P0.05。 6、HIV-1gp41-I90可以增强新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的黏附和迁移作用以PBS、Cn、HIV-1gp41-I90和HIV-1gp41-I90+Cn的四个组分别感染HBMEC诱导THP-1的相对黏附率分别是100±0%、186.5±7.47%、150.7±2.8%和228.6±29.3%,各组相比对照组,相对黏附率均有显著差异,P0.01; HIV-1gp41-I90+Cn组和单纯Cn组相比,相对黏附率有显著差异,P0.01; HIV-1gp41-I90+Cn和单纯HIV-1gp41-I90组相比,相对黏附率有特别显著的差异,P0.001。从迁移实验看,不论是gp41或Cn单独作用于HBMEC,还是HIV-1gp41和Cn共同作用于HBMEC,其迁移率相对于对照组都有明显提高(P0.01),且随着后者相互作用的时间延长,迁移率亦随着增加；根据重复测量数据方差分析的组间多重比较的结果,gp41+Cn组相比对照组和单纯gp41组有明显差异(P0.01)。 7、HIV-1gp41-I90增强Cn感染HBMEC诱导THP-1趋化迁移的作用可能与CD44分子密切相关 Bikunin的4个浓度组0.1nM、1nM、5nM和20nM)抑制HIV-1gp41-I90增强Cn感染内皮细胞诱导THP-1的迁移率分别为19.21±3.71%%、15.22±2.99%、12.75±1.9%和11.725±4.84%,5nM和20nM浓度组与对照比较有显著差异,P0.01。另外,CD44免疫荧光观察发现,内皮细胞上表达的CD44荧光信号在HIV-1gp41-I90+Cn组最强。四、统计学分析数据用均数±标准差表示,统计方法采用SPSS13.0统计软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和重复测量数据的方差分析进行,方差不齐时进行变量转换。P0.05时差异有统计学意义。五、结论 1、新生隐球菌体外感染脑微血管内皮细胞可以诱导THP-1的黏附和迁移。 2、新生隐球菌体外感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1黏附和迁移的作用可能与CD44分子密切相关。 3、HIV-1gp41-I90作用脑微血管内皮细胞可以诱导THP-1的黏附和迁移。 4、HIV-1gp41-190可以增强Cn感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1的黏附和迁移。 5、HIV-1gp41-190增强Cn感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1趋化的作用可能与CD44分子密切相关
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R519.4

【参考文献】