核糖体蛋白S29功能研究

发布时间：2018-03-18 16:14

本文选题：核糖体蛋白S29　切入点：抗药性　出处：《南京医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分核糖体蛋白S29(RPS29)参与蚊抗药性机制研究蚊媒病是全球重要的人类传染病。蚊媒控制一直是蚊媒病防治的重要手段。化学防制是蚊媒控制的有效方法。然而长期大量地使用杀虫剂,导致蚊媒抗药性的发生和发展,蚊媒病防治效果不断下降。抗药性已经成为蚊媒病防治中的最大障碍。抗药性是由基因决定的,是可遗传的复杂的生物进化现象,涉及到多个基因、多种机制的作用。鉴定新的抗药性基因并研究其如何参与抗药性成为蚊媒抗药性领域新的研究热点。本实验室前期采用抑制性差减杂交(SSh)结合cDNA芯片法高通量筛选,获得多个蚊溴氰菊酯抗性相关基因,其中包括在抗性品系中高表达的核糖体蛋白s29基因(rps29),且已证明RPS29与蚊溴氰菊酯抗性相关。本课题在前期工作基础上,通过串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)方法找寻RPS29相互作用蛋白,并用GST-pull down及免疫荧光两种方法加以验证；通过将RPS29与其相互作用蛋白共同高、低表达的方法研究二者相互作用对蚊细胞溴氰菊酯抗性的影响；通过实时荧光定量PCR结合Western blot的方法,探究RPS29与相互作用蛋白之间的作用机制。本研究通过TAP方法成功获得RPS29相互作用蛋白质CYP6N3。GST-pull downs实验结果表明,RPS29与CYP6N3可在体外发生直接相互作用。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜结果发现,RPS29在细胞质与细胞核均有分布,CYP6N3在细胞质分布,RPS29与CYP6N3可在细胞质发生相互作用。将RPS29与CYP6N3共同高表达,在溴氰菊酯各浓度组处理后,结果发现,RPS29高表达组的细胞存活率呈下降趋势,CYP6N3高表达组的细胞存活率呈上升趋势,而RPS29与CYP6N3共同高表达组的细胞存活率介于二者之间。将RPS29低表达,在溴氰菊酯各浓度组处理后,结果发现,RPS29低表达组的细胞存活率有所上调,CYP6N3高表达组的细胞存活率呈上升趋势,而RPS29低表达CYP6N3高表达组的细胞存活率高于所有组别。将CYP6N3低表达,在溴氰菊酯各浓度组处理后,结果发现,CYP6N3低表达组的细胞存活率呈下降趋势,RPS29高表达组的细胞存活率亦呈下降趋势,RPS29高表达CYP6N3低表达组的细胞存活率低于所有组别。为进一步研究RPS29与CYP6N3相互作用机制,本研究将CYP6N3梯度高表达,实时定量PCR检测发现RPS29mRNA表达水平未发生改变；western blot检测发现RPS29蛋白表达呈梯度增高的趋势。将RPS29梯度高表达,实时定量PCR检测发现CYP6N3mRNA表达水平未发生改变；western blot检测发现CYP6N3蛋白表达呈梯度下降的趋势。蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,被抑制的CYP6N3蛋白表达呈明显的时间梯度恢复。本研究首次筛选RPS29相互作用蛋白质；证明RPS29与CYP6N3可在细胞内外发生相互作用,且二者相互作用可以调控蚊细胞溴氰菊酯抗性；而且探讨了RPS29与CYP6N3相互作用机制。本研究结果为进一步阐明杀虫剂抗性机制和建立新的抗药性检测方法提供科学依据。第二部分核糖体蛋白S29(RPS29)参与核糖体蛋白转录调控机制研究 RPS29是核糖体小亚基上的成员,在进化上高度保守。有研究报道,RPS29具有锌指结构,该结构可以使蛋白质与DNA或者RNA结合。本研究前期结果发现,RPS29可在细胞核分布。以上结果表明RPS29可能作为转录因子。因此,本课题进一步研究了RPS29对其它核糖体蛋白转录调控的机制。核糖体是细胞内蛋白质合成场所。大量研究表明其亦与细胞生长、分化、胚胎发育、肿瘤、免疫疾病等紧密相关。核糖体的构建是一项高度精密的过程,需要大量特定的基因协同表达与调控。当某一核糖体蛋白过度表达、缺失或结构异常,均会影响核糖体的组装,进而导致蛋白质合成异常,影响细胞功能。上游启动子对核糖体蛋白基因协同表达的影响主要体现在转录水平上。目前,上游启动子对核糖体蛋白基因协同表达影响的研究,主要集中于寻找上游启动子区域的共调控元件。Wong小组发现人核糖体蛋白基因启动子区域有5个保守结构域,将其命名为MSMs,并推测这5个MSMs可能作为核糖体蛋白基因协同表达共调控元件。本研究在本实验室与Wong小组前期工作的基础上,在4株不同细胞系中,通过RNA干涉的方法低表达RPS29,研究其对其它核糖体蛋白mRNA表达的影响；采用双荧光报告系统检测MSMs功能,并低表达RPS29后,再检测其功能改变情况；通过凝胶迁移(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)方法研究RPS29与MSMs相互作用情况。将RPS29低表达后,通过芯片检测70种核糖体蛋白mRNA情况,结果发现,在4株细胞系中,绝大部分核糖体mRNA表达均发生下调。根据核糖体蛋白在大小亚基上的分布,将大亚基上下调的核糖体蛋白数目与小亚基上下调的的核糖体蛋白数目比较,结果显示,在4株细胞系中,大、小亚基上下调的核糖体蛋白数目相近,比率均接近于1。当RPS29下调后,有20种核糖体蛋白在4株细胞系中均下调。本研究随机选取其中10种核糖体蛋白,检测RPS27下调后,这10种核糖体蛋白mRNA表达情况。结果显示,在4株细胞系中,10种核糖体mRNA表达大部分未改变,少部分上调。采用双荧光报告系统,在16hBE、LTEP-a-2、 A549等3株细胞系中,检测5个MSMs功能。结果表明,MSM-a, MSM-b、MSM-c、MSM-d在3株细胞系中均有显著的增强效应,而MSM-e未检测出。将RPS29低表达后,在16hBE细胞系中,MSM-d的增强效应显著下调；在LTEP-a-2细胞系中,MSM-b与MSM-d的增强效应显著下调；在A549细胞系中,MSM-a与MSM-d的增强效应显著下调。进一步通过EMSA实验检测RPS29与MSMs相互作用情况,结果显示RPS29与MSMs未能发生直接相互作用。本研究发现RPS29可在转录水平调控其它核糖体蛋白协同表达；并首次通过实验证明MSMs具有增强子功能,且RPS29可以影响MSMs这一功能；率先提出RPS29与MSMs间接相互作用调控其它核糖体蛋白协同表达这一观点。本研究结果为阐明核糖体蛋白基因协同表达调控机制提供科学依据。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R51;R3411

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