HCV核心蛋白作用下的巨噬细胞变化及在肝细胞增殖中的相互作用

发布时间：2018-03-20 19:00

本文选题：HCV　切入点：core　出处：《河北医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：越来越多研究表明，嗜肝性丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是导致慢性化肝炎、乃至原发性肝癌的主要病原体，HCV不仅可以感染肝细胞，在很多免疫细胞（如B细胞、T细胞、单核巨噬细胞）内也可检测到HCV的复制，且HCV的病毒蛋白可与寄宿细胞内、外的相应蛋白或受体结合，影响该细胞的生物学活性：如非结构蛋白NS3可通过封闭TLR3途径抑制固有免疫应答或通过活化TLR2受体途径促进固有免疫应答发生；胞膜蛋白E2与NK细胞表面受体CD81结合抑制NK细胞功能等。提示在HCV感染宿主过程中，与宿主免疫细胞可能通过多种途径相互作用，而HCV、免疫细胞、肝细胞三者的相互影响，既有可能促使HCV的清除，也有可能有利于HCV的免疫逃逸，导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的发生。 HCV核心蛋白（HCV core）作为HCV的重要结构蛋白，是病毒核衣壳的组成部分，除参与病毒的组装，还会影响着宿主细胞内的信号转导、物质代谢以及凋亡等一系列生化过程：如转染HCV core的HepG2可通过自分泌TGF-α，引起细胞内MAPK/ERK通路活化，，最终导致HepG2的增殖加快；HCV core还可抑制抑癌基因p53启动子的活性，参与HCC的发生。库否氏细胞是定居于肝脏内的一类重要的巨噬细胞，约占肝脏细胞总数的15%～20%，发挥重要的免疫监视和免疫调节作用。然而在HCV持续感染时，表达HCV core蛋白的受体C1qR的单核细胞可被募集到肝脏组织，在肝脏炎性微环境中分化为不同亚型的巨噬细胞，包括经典激活的巨噬细胞M1、替代途径激活的巨噬细胞M2、肿瘤相关巨噬细胞、髓系来源的抑制细胞等，这些不同亚型巨噬细胞可分泌不同的细胞因子，在病毒的感染与肿瘤的形成及扩散中发挥不同的作用。换言之，在HCV的慢性感染过程中，HCV core蛋白与巨噬细胞表面受体C1qR结合导致巨噬细胞发生了哪些生物学变化，这些变化与HCV所致的疾病的进程有哪些关系，以及在肝脏微环境中肝细胞与巨噬细胞之间是如何互相制约，互相协调都不十分清楚。本研究旨在了解在HCV core蛋白作用下的巨噬细胞与不同的人肝细胞株相互作用后，肝细胞和巨噬细胞发生的变化，以期探讨巨噬细胞在HCV导致的HCC中所充当的角色，为HCV的慢性化机制的研究和免疫治疗提供新的视角。因此，采用了以下实验策略：1、应用原核表达系统获得HCV core蛋白，作用巨噬细胞后，分别收集细胞培养上清及巨噬细胞与不同人肝细胞株（L02、HepG2）相互作用，研究HCV core蛋白作用后的巨噬细胞与肝细胞增殖的关系；2、在了解HCV作用下的巨噬细胞培养上清可以促肝细胞增殖的前提下，用Transwell小室培养系统（非直接接触）共培养HCV core蛋白、巨噬细胞及人肝细胞株（L02、HepG2），通过肝细胞内信号转导分子表达的变化，深入研究相关机制；3、根据以上实验结果，通过RT-PCR、ELISA、Western blot、流式细胞术等手段了解巨噬细胞内转录因子、炎性细胞因子以及细胞膜分子的变化以深入揭示HCV core蛋白以及肝细胞代谢对巨噬细胞的作用。方法： 1PCR方法从JFH-1株(HCV2a)全长基因质粒上扩增HCV core基因,克隆至pMD18-T载体并测序，后经BamHI和HindⅢ双酶切，将其克隆至原核表达质粒pET-28a构建重组原核表达质粒pET-28a/HCV core，通过IPTG诱导获得高效表达目的蛋白的包涵体，经纯化和复性、LPS定量检测后，行SDS-PAGE和Western blot鉴定。 2PMA诱导人单核细胞株Thp1分化为巨噬细胞PMA-Thp1，以RT-PCR检测HCV core蛋白作用后细胞表面受体C1qR mRNA表达水平，验证原核表达蛋白HCV core的生物学活性，同时设PBS、LPS作用PMA-Thp1作为对照；使用不同浓度HCV core蛋白作用PMA-Thp1，确定HCV core蛋白作用最适浓度。 3HCV core蛋白作用PMA-Thp1后收集细胞培养上清，以不同浓度（10%细胞培养上清+90%完全培养基、20%细胞培养上清+80%完全培养基、40%细胞培养上清+60%完全培养基）分别与人肝细胞株L02、HepG2共培养，CCK8法检测培养不同时间点（24h、48h、72h）肝细胞增殖的动态变化，同时设PBS作用的PMA-Thp1细胞培养上清或仅含有HCVcore蛋白的完全培养基作用的肝细胞组作为阴性对照和蛋白对照。 4HCV core蛋白作用PMA-Thp124h后收集PMA-Thp1细胞，经丝裂霉素处理后分别与人肝细胞株L02、HepG2共培养（肝细胞与PMA-Thp1细胞数比值分别为25:1、50:1），CCK8法检测培养不同时间点（24h、48h、72h）肝细胞增殖的动态变化，同时以PBS作用的PMA-Thp1细胞或仅含完全培养作用的肝细胞组作为阴性对照和阳性对照。 5用Transwell小室培养系统将HCV core蛋白作用的PMA-Thp1细胞分别与人肝细胞株L02、HepG2（非直接接触）共培养24h，行Westernblot检测肝细胞内MAPK通路相关蛋白（ERK、JNK、p38）的活性，同时设PBS作用PMA-Thp1共培养的肝细胞组、HCV core单独作用的肝细胞组及肝细胞组作为对照。 6HCV core蛋白作用PMA-Thp1后，RT-PCR检测PMA-Thp1细胞促炎和抗炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-β）mRNA水平变化；ELISA检测PMA-Thp1细胞培养上清抗炎因子TGF-β的表达变化；流式细胞术检测PMA-Thp1细胞膜表面与M1、M2巨噬细胞表型有关分子（CD14、CD16、CD206、CD86）表达变化，同时设PBS、LPS、LPS+HCVcore作用的PMA-Thp1组作为对照；Western blot检测HCV core蛋白、肝细胞共同作用的PMA-Thp1细胞内转录因子（NF-κB、STAT3、STAT1）的活性。结果： 1成功构建了pET28a/HCVcore原核表达质粒，并得以表达。经鲎试剂检测表达蛋白中LPS含量为0.9EU/ml。SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示，纯化后获得分子量约为21KD的单一条带，可与鼠抗人HCVcore单克隆抗体特异性杂交。 2经细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞表面分子（CD11b、CD11c），结果显示，以40ng/ml佛波酯（PMA）作用Thp148h后，细胞形态发生改变，巨噬细胞特异的细胞表面分子CD11b、CD11cmRNA水平显著升高（P0.05）。 3Real-time PCR结果显示： HCV core蛋白作用PMA-Thp16h、12h后其受体C1qR mRNA水平显著高于对照组（P0.05）；并确定HCV core作用PMA-Thp1最适浓度为10μg/ml。 4细胞增殖曲线显示HCV core蛋白作用PMA-Thp1收集细胞培养上清对L02细胞增殖的影响：与阴性对照组相比，不同浓度细胞培养上清均使L02细胞增殖加快；与阴性对照和蛋白对照组相比，20%细胞培养上清使L02增殖显著（P0.05）。 5细胞增殖曲线显示HCV core蛋白作用PMA-Thp1收集细胞培养上清对HepG2细胞增殖的影响：10%细胞培养上清作用的HepG2在24h、48h、72h时间点生长均大于阴性对照和蛋白对照组，其中48h、72h时间点差别显著（P0.05），20%上清组和40%上清组对HepG2增殖作用不明显。 6HCV core蛋白作用PMA-Thp1后收集的细胞经丝裂霉素固定后与肝细胞共培养，与对照组相比，无明显促肝细胞增殖作用，说明巨噬细胞膜分子对肝细胞增殖作用无影响。 7Western blot显示HCV core蛋白作用PMA-Thp1与人肝细胞株共培养后，与对照组比较，L02细胞内磷酸化的ERK表达明显升高，但磷酸化的JNK和p38表达没有改变；而HepG2细胞内只有磷酸化的JNK表达明显升高。 8HCV core蛋白作用PMA-Thp1不同时间后，（1） RT-PCR结果显示：细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-βmRNA水平与PBS对照组比较均有明显改变（P0.05）；（2）ELISA结果显示：细胞培养上清中TGF-β的表达明显高于对照组（P0.05），含量为168pg/ml；（3）流式细胞术检测结果显示：细胞膜表面分子CD14、CD16、CD206的表达与其他三组均无区别，CD86表达与PBS作用组相同；（4）Western blot结果显示：与PBS对照组相比，磷酸化的NF-κB65和NF-κB105表达在1h和4h升高，磷酸化的STAT1和STATR3表达无明显动态改变。 9HCV core蛋白、肝细胞、巨噬细胞三者相互作用致与巨噬细胞分化有关的转录因子的表达和活化：（1）与core蛋白、L02细胞共培养的巨噬细胞磷酸化的STAT3的表达明显增加，而与core蛋白、HepG2共培养的巨噬细胞的磷酸化STAT3的表达则无明显改变；（2）与L02细胞、巨噬细胞共培养的对照组相比，L02、巨噬细胞、core蛋白三者共培养致磷酸化的STAT3表达升高的同时，磷酸化的STAT1表达为降低状态。结论： 1成功构建、表达了具有生物学活性的HCV core蛋白。 2HCV core蛋白作用PMA-Thp1巨噬细胞后的细胞上清有促进肝细胞株L02、HepG2增殖的作用，可能与巨噬细胞分泌的可溶性因子有关，而与巨噬细胞表面分子以及HCV core蛋白直接作用无关。 3HCV core蛋白作用PMA-Thp1后促进肝细胞的增殖，在L02细胞可能与上调磷酸化的ERK表达相关，反之，L02细胞、core蛋白、巨噬细胞三者共培养可上调巨噬细胞内磷酸化STAT3的含量。而对HepG2细胞的影响仅表现为磷酸化的JNK含量上调，HepG2对巨噬细胞的影响作用不明显。 4HCV core蛋白作用PMA-Thp1可致细胞转录因子和细胞因子表达发生动态改变，但与不同肝细胞相互作用后的结果不完全相同，提示与不同特性肝细胞的相互作用可影响巨噬细胞的生物学功能。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63

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