干扰素刺激基因15在HIV-1感染中的作用研究

发布时间：2018-03-20 16:18

本文选题：HIV-1　切入点：ISG15　出处：《复旦大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：ISG15(Interferon-Stimulated Gene15, ISG15)是由干扰素诱导产生的一类泛素样蛋白分子,大小为15KD,成熟的ISG15蛋白包含两个泛素样结构域。ISG15能与靶蛋白分子通过共价结合发挥修饰作用,这一过程称为ISG化(ISGylation)。ISG化过程与泛素化类似,是由多种酶催化的级联反应,该反应系统包括ISG15激活酶E1(UBE1L)、结合酶E2(UBCH8)、连接酶E3(HERC5)和ISG15特异性蛋白酶USP18。由于ISG15及其修饰酶系统在病毒感染或干扰素(Interferon,IFN)刺激后大量诱导表达,因此ISG15介导的ISG化为干扰素介导抗病毒作用的重要途径之一。 HIV-1子代病毒的组装出芽、成熟以及感染性颗粒的形成均需要泛素化的辅助。研究表明HIV-1病毒感染后通过干扰素途径上调ISG15蛋白,后者介导的ISG化能竞争性抑制Gag蛋白的泛素化来干扰其复制,因此ISG15介导的泛素化修饰过程可能是其抗病毒效应通路之一。而早期研究发现ISG15和HIV-1的Gag蛋白没有直接相互作用,目前为止尚无ISG15和HIV-1其他蛋白直接相互作用的相关报道。另少量研究显示ISG15能通过阻断Gag蛋白组装出芽过程而抑制HIV-1病毒的有效释放,推测其机制可能是通过对胞内转运必须复合体(Endosomal Sorting Complex Required for Transport, ESCRT)成分的ISG化修饰而实现。本实验室对HIV-1慢性感染者队列连续多年的观测结果显示,ISG15与HIV/AIDS疾病进展密切相关。HIV-1的感染能调节胞内限制因子的表达；而胞内限制因子的作用可能直接影响HIV-1感染宿主的后果(感染成功与否、典型进展和慢性进展等),其中达到一个平衡。但是对ISG15在HIV-1感染过程中的功能、作用方式以及可能存在的机制仍然知之甚少。值得庆幸的是,目前HIV-1似乎并未发展出拮抗ISG15抑制效应的相应机制,这一点提示ISG15用于抗HIV-1治疗极具潜力。因此HIV-1感染情况下ISG15在不同细胞亚群中的表达情况及相应的应答通路的研究显得尤为重要。本研究首先利用体外细胞系感染模型,分别检测HIV-1感染的细胞系中转录和翻译水平ISG15的表达及细胞上清中p24蛋白水平,探讨了HIV-1感染对ISG15表达的影响及后者对前者的抑制效应。在6种HIV-1易感细胞系中,以IFN-a2b刺激作为阳性对照,利用HIV-1感染性克隆pNL4-3转染293T、TZM-bl和Hela细胞；HIV-1假病毒感染Jurkat、MT-4和THP-1细胞,通过荧光定量PCR(qPCR)和Western-Blot的方法分别在转录和翻译水平检测了ISG15的表达。发现HIV-1感染或pNL4-3转染后ISG15转录水平明显上调,且在THP-1和TZM-bl细胞中尤为显著。但除了TZM-bl细胞,其他5种细胞系中没有表现出ISG15蛋白水平的上调。进一步构建ISG15真核表达质粒,与HIV-1感染性克隆pNL4-3共转染。结果显示,293T细胞中ISG15能抑制HIV-1病毒颗粒的产生和成熟,并且这种抑制作用呈现时间剂量依赖性；TZM-bl中虽然也有显著的抑制作用,但是趋势不同。HIV-1感染明显上调ISG15转录但却无ISG15蛋白产生,提示该病毒能对抗固有免疫活化及效应。体外细胞模型的研究结果需要在HIV-1感染者队列中加以验证才具有意义,并最终提示ISG15的临床应用前景。因此,本研究以HIV-1慢性感染者队列为研究对象,以健康志愿者作为对照,采集血样,分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs),分别在转录水平和翻译水平检测了不同进展期病人不同细胞亚群中ISG15的表达情况。对健康人、HIV-1感染治疗者(ART+)、感染未治疗的慢性进展者(SP)和典型进展者(TP)中ISG15表达情况进行了系统的描述、分析了病人PBMCs对IFN刺激的响应性以及ISG15表达和疾病进展的相关性。结果显示,HIV-1慢性感染者PBMCs中ISG15转录水平较高,而在蛋白水平HIV-1慢性感染者和健康志愿者之间没有显著差异；但是HIV-1慢性感染者的PBMCs对IFN刺激的响应性显著下降。不同细胞亚群的分析显示单核细胞中ISG15的表达量最高,提示单核细胞可能是ISG15介导抗HIV-1作用的关键细胞亚群。相关性分析显示HIV-1慢性感染者PBMCs中转录水平ISG15的表达和病毒载量以及CD4细胞计数之间存在一定的相关性。总之,本研究对HIV-1慢性感染者中ISG15的表达情况进行了系统的描述,同时发现ISG15的表达和HIV-1疾病进展相关,为HIV-1感染的预防和治疗提供了理论依据和新思路。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.91

【参考文献】