黄酮类化合物抗HCV活性研究

发布时间：2018-04-10 08:14

本文选题：丙型肝炎　切入点：HCV　出处：《昆明理工大学》2014年硕士论文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)为单股正链RNA病毒,属黄病毒科,丙型肝炎病毒属。据统计,全世界约有1.85亿人感染HCV,75%-85%的感染者会发展为慢性肝炎,近30%的慢性感染者最终会发展为肝硬化甚至肝癌。HCV主要经由血液传播,包括输血传播,静脉吸毒,性接触与无保护分娩等。由于多数丙肝患者无明显的临床症状,大部分患者在出现临床症状再就医时已经发展为肝硬化甚至肝癌,致使人类生命健康受到严重威胁。丙型肝炎的临床常用治疗药物为干扰素/利巴韦林联合疗法,其治疗有效率及病程进展很大程度上取决于感染病毒的基因型。其中,干扰素对1型和4型HCV感染的治疗效果差,而基因3型HCV感染与脂肪病变和纤维化高度有关。尽管最近以依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)为靶点的抗病毒药物sofosbuvir(也称PSI-7977)的使用,较大程度提高了患者持续性病毒学应答率,由于病毒在此区段固然发生的基因变异,仍可导致耐药发生,亟待开发新型抗病毒药物。黄酮类化合物的抗病毒活性已被广泛报道。本研究为验证该类化合物对HCV的抑制效果,在J6/JFH1-Huh7.5.1HCV细胞培养体系的基础上,以WST法检测化合物对Huh7.5.1细胞的细胞毒性,Real time RT-PCR法检测化合物对HCV的抑制作用,将得到的选择指数SI值(IC50/EC50)与阳性对照药物RBV比较,从而判断化合物的抗病毒效果。其中,阳性对照药物聚乙二醇IFN-α2b无明显细胞毒性,半数有效浓度(EC50)约为0.354IU/mL。利巴韦林半数细胞生长抑制浓度(IC50)为21.04μg/mL,半数有效浓度(EC50)为2.19μg/mL,选择指数(SI)为9.6。在此药物筛选体系基础上对50种化合物进行了抗HCV活性初筛,得到23种抗HCV有效化合物,27种抑制效果不明显化合物。间接免疫荧光法通过检测化合物不同浓度处理组core蛋白的表达水平(荧光的表达)做为HCV RNA检测的替代指标,并以此为指标评价化合物抗病毒效果。正交试验得出实验用最佳细胞密度为1×104个细胞/孔,病毒最适感染复数为1。通过观察荧光的表达来检测6种初筛有效化合物对HCV的抑制作用,其中阳性对照药物干扰素在1-100IU/mL的范围内可以有效抑制病毒的产生,只有在0.1IU/mL才观察到60%左右的荧光。利巴韦林在100-1000μg/mL的浓度范围内对HCV抑制率达90%,半数抑制浓度在1-10μg/mL之间。6种初筛有效化合物中,黄酮类衍生物58153a,58158a和6518在其最大浓度可以有效抑制HCV,但因其细胞毒性较大,无法反应化合物对病毒的抑制效果。其它浓度的细胞对照组均没有发现明显的细胞毒性,并随着化合物浓度的降低,荧光数逐渐增加。FMR-04的细胞毒性和抗病毒效果呈剂量依赖趋势,最低浓度的抑制率高50%。WDC-14和WDC-17细胞毒性较小,在最高浓度对HCV的抑制达90%以上,与病毒对照组比较,两种化合物在最低浓度均未观察到50%以上的荧光。通过测定6种初筛有效化合物无明显细胞毒性浓度抑制后的病毒上清的感染滴度,进一步验证6种化合物对HCV的抑制作用。不加药组的病毒滴度为7×105.25PFU/mL,阳性对照药物干扰素(10IU/mL)处理后病毒滴度为7×101.77PFU/mL,远小于病毒对照组。黄酮类衍生物58153a(10μg/mL)和58158a(7.5μg/mL)作用后的病毒滴度非常相近,分别为7×104.5PFU/mL和7×104.4PFU/mLWDC系列的WDC-14和WDC-17化合物在20μg/mL的浓度对病毒抑制后的感染滴度均为7×10367PFU/mL。FMR系列的FMR-04(20μg/mL)作用后的病毒滴度为7×1045PFU/mL。黄酮类衍生物6518(10μg/mL)对病毒的抑制效果最好,经其抑制后病毒感染滴度为7×103.5PFU/mL。用Macsynergy Ⅱ软件的三维剂量效应表面分析4种有效化合物与干扰素联合使用的抗病毒效果。化合物6518高浓度时,表现出一定的协同效应,但总体表现为拮抗作用。化合物58153a和FMR-04表现出明显的拮抗作用,WDC-14总体表现为协同作用。采用三种不同加药方式初步探索化合物有效作用时段。化合物58153a主要作用于病毒吸附于宿主细胞前的过程或与病毒复制相关的宿主因子,6518主要作用于病毒吸附后的过程如病毒翻译、复制等相关环节,FMR-04主要作用于病毒吸附后的早期阶段如病毒脱衣壳、翻译、复制等相关环节,而WDC-14主要作用于病毒吸附后的后期阶段的病毒翻译、复制等相关环节。本研究对黄酮类化合物进行了一系列的筛选,最终获得的4种有效抗病毒化合物可为抗HCV的黄酮类化合物的新药设计和研发及临床用药提供重要参考。
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【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.63

【参考文献】