发热伴血小板减少综合征病毒传播机制及人源单克隆抗体研究

发布时间：2018-04-11 13:12

  本文选题：发热伴血小板减少综合征病毒 + 动物宿主　； 参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：背景发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),属布尼亚病毒科白蛉病毒属,是一种分节段的单股负链RNA病毒,基因组包括L、M和S三个片段。由SFTSV感染所致的疾病称为发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS),临床表现为发热、头痛、乏力、肌肉酸痛、全身不适、恶心和呕吐等,严重者出现多器官衰竭甚至死亡。SFTS流行于东亚,包括中国、日本和韩国。SFTS的病死率高达30%,平均约12%。SFTSV经蜱叮咬传播,也可通过接触病人血液和分泌物感染。蜱为吸血媒介,可被其吸食血液的动物分布广泛,但这些动物,特别是小型哺乳动物在SFTSV传播过程中的作用尚不明确。SFTSV可能起源于中国中部淮阳山区域,但病毒在中国、日本和韩国的传播路径尚不清楚。目前针对该疾病,既无特效药物,也无有效的疫苗可供使用,对患者主要采取广谱抗病毒治疗和对症支持治疗。针对危重患者,中和抗体治疗将是行之有效的方法。SFTS流行特征的解析、传播模式的探讨及抗体药物的研发,对丰富SFTS的病原学知识、流行病学理论、疾病的预防控制和诊断治疗具有重要意义。目的通过监测、分析自然状态下小型宿主动物SFTSV感染状况,探讨其在SFTSV传播过程中所起作用,为该病的预防控制提供理论依据;通过对SFTSV全基因组进行遗传进化分析,探讨SFTSV起源及可能传播路径,为SFTS的流行趋势预测提供重要线索;研究SFTSV人源单克隆抗体,为SFTS的特效治疗提供科学依据。方法1.动物标本采集及检测(1)2013年1月至8月,以山东省青岛市黄岛区胶南地区为调查点,捕获宿主动物,并对宿主动物进行种属鉴定,采集宿主动物脾脏、肝脏和心脏血标本。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测心脏血SFTSV总抗体。自宿主动物脾脏提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(reversed transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及巢式PCR扩增SFTSV M和S片段部分基因序列,并进行序列测定。测序结果运用NCBI-BLAST与数据库比对分析,判断其是否为SFTSV序列,并将所得到的SFTSV序列上传至NCBI数据库,获得GenBank号码。根据ELISA和PCR扩增结果,分别计算宿主动物SFTSV抗体阳性率和SFTSV带毒率,并综合抗体阳性率和宿主动物带毒率,计算宿主动物感染率。(2)将所得序列与自NCBI获得的参考株序列建立数据集,以Mega 5.0软件Clustal W程序进行比对,采用Neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型,构建系统发生树并进行自展信度检验。2.SFTSV遗传进化分析(1)从NCBI GenBank数据库搜索并下载SFTSV病毒株序列信息,明确每株病毒标本采集时间、地点。对病毒株的L、M和S片段序列进行系统发育分析,采用最大似然法(Maximum Likelihood Method)构建系统进化树。(2)利用基因重组预测软件 Recombination Detection Program version 3.44(RDP3)对病毒全基因组进行初步预测,确定可能的基因重配株。结合L、M和S片段序列系统发育分析中病毒株的分布,确定基因重配株。(3)基于贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛(Bayesian Markov chain Monte Carlo,MCMC)原理及分子钟模型,运用软件BEASTv1.8.0对病毒株的L、M、S片段序列及全基因组序列进行分析,确定病毒SFTSV的进化速率、分化时间及最近共同祖先(the most recent common ancestor,TMRCA)出现的时间。为检验病毒的进化速率是否是随机的,对序列信息进行随机化,用真实时间数据得出的进化速率和随机化的进化速率进行比较,从而确定病毒的进化速率是否是随机的。基于病毒重配和分化时间对病毒传播路径进行分析推测。3.SFTSV人源单克隆抗体制备及生物学功能研究(1)利用蛋白质跨膜区预测软件预测SFTSV糖蛋白跨膜序列,确定胞外区序列。构建包含SFTSV糖蛋白Gn和Gc胞外区的重组真核表达质粒,并表达纯化蛋白Gn、Gc。(2)从病人外周血中分离单个核细胞,采用流式细胞术分选针对SFTSV糖蛋白的记忆B细胞。RT-PCR、PCR扩增记忆B细胞中抗体可变区基因序列,重叠PCR法将抗体可变区与恒定区连接,构成抗体轻、重链全序列。将抗体轻、重链全序列克隆入真核表达载体,构建重组真核表达质粒。将包含抗体轻、重链全序列的重组真核表达质粒共转染哺乳动物细胞HEK293T,利用Western Blot初步筛选可以表达抗SFTSV Gn或Gc抗体的轻、重链质粒组合。对初步筛选到的抗体,利用ELISA、间接免疫荧光和空斑减少中和试验进一步研究抗体的蛋白结合活性、病毒结合活性和中和活性。结果1.捕获动物种属构成及感染状况(1)2013年1～8月,在山东省青岛市黄岛区胶南地区,共捕获小型哺乳动物774只,涵盖2目3科5属6种,包括褐家鼠(157只,20.3%)、小家鼠(183 只,23.6%)、大仓鼠(135 只,17.4%)、黑线姬鼠(188 只,24.3%)、黑线仓鼠(18只,2.3%)及，

本文编号：1736152