Eno、Fba定量检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值评估

发布时间：2018-04-16 05:38

本文选题：侵袭性念珠菌病 + 白念珠菌　；参考：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：背景念珠菌属是引起院内血流感染的第4位致病菌,在ICU病人中上升为第3位致病菌,其中白念珠菌仍是最常见的致病菌(占50%-70%)。侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)起病隐匿,缺乏早期特异症状,给临床诊断带来困难,不能进行及时有效的治疗,侵袭性念珠菌病的死亡率可高达40%。缺乏早期有效的实验室诊断指标是造成IC诊断困难的重要原因。目前血培养和组织活检被认为是IC的实验室诊断“金标准”,其中血培养敏感性差、耗时长,且不伴有念珠菌血症的深部念珠菌病患者会出现漏诊,往往延误病人诊断和治疗；组织活检为创伤性检查,危重病人难以承受。研究证明,及时的诊断和治疗能有效改善IC病人的预后,因此迫切需要寻找可靠有效的IC实验室诊断标志物并建立其检测方法,提高IC的实验室诊断水平。近20年来,以念珠菌特异抗原和抗体为检测对象的血清学方法,凭借其敏感、简便、易于开展的优势,成为IC实验室诊断研究领域的热点。念珠菌抗原检测可以为IC诊断提供直接的依据,理想的抗原标志物还可以用来监测治疗效果和判断预后。现有用于IC诊断的抗原指标(1,3)-p-D-葡聚糖和甘露聚糖敏感性和特异性尚不理想,寻找新的诊断标志物可以提高IC的实验室诊断水平。白念珠菌烯醇化酶(‘cnolase, Eno)由440个氨基酸组成,分子量在45-48kD之间,催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸,同时在糖异生过程中催化逆向反应。果糖二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase, Fba)由359个氨基酸组成,分子量约为39kD,催化1,6-二磷酸果糖分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛的可逆反应。Eno和Fba是糖酵解中的关键酶,在念珠菌能量代谢中起重要作用。Eno和Fba存在于念珠菌细胞壁与胞浆内,是白念珠菌中含量最丰富的可溶性蛋白,在白念珠菌呈菌丝相生长时,Eno和Fba表达明显上调,提示两者与白念珠菌侵袭生长相关,被认为是菌丝相特异蛋白。血清蛋白质组学分析显示,Eno和Fba可引发机体强烈的免疫应答,产生高滴度的IgG抗体,是IC进程中的免疫优势抗原。基于Eno和Fba具有以上的特点,我们认为Eno和Fba具有成为IC诊断标志物的潜在优势,在本研究中对两者在IC中的诊断价值进行了评估。目的应用前期获得的白念珠菌Eno、Fba多克隆抗体和单克隆抗体、白念珠菌Eno和Fba重组蛋白,建立定量检测Eno和Fba的双抗体夹心ELISA法。通过建立免疫正常和免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性念珠菌感染模型,获得Eno和Fba在IC中的动力学资料。检测IC患者和健康对照血清中Eno和Fba水平,评估Eno和Fba在IC病人中的早期诊断价值。方法 1.定量检测Eno、Fba双抗体夹心ELISA法建立应用抗原偶联NHS活化琼脂糖纯化羊抗Eno和羊抗Fba多克隆抗体,G蛋白亲和层析柱纯化抗Eno和抗Fba单克隆抗体。用不同念珠菌胞浆蛋白、重组蛋白Eno和重组蛋白Fba进行免疫印迹,检测纯化后的Eno和Fba单克隆及多克隆抗体的特异性。利用单克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的多克隆抗体作为检测抗体,重组蛋白作为标准品,建立定量检测Eno和Fba的双抗体夹心ELISA法,考察方法的精密度、特异性、线性范围、最低检测下限、血清回收率等性能指标。 2.体外真菌培养上清Eno和Fba定量检测应用建立的定量检测Eno、Fba双抗体夹心ELISA法检测常见念珠菌和新型隐球菌、酿酒酵母培养上清液,对建立的双抗体夹心ELISA检测性能进行初步评价。 3.IC感染动物模型血清和肾匀浆Eno和Fba定量检测 4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为免疫抑制组(n=25)、免疫正常组(n=25)和正常对照组(11=5)。采用孢子注射前4天和当天,腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg,孢子注射后隔日腹腔注射环磷酰胺75mg/Kg的方法,建立小鼠的免疫抑制状态。经尾静脉接种5×106CFU/ml的白念珠菌标准菌株ATCC90028孢子混悬液0.1ml,建立免疫正常小鼠和免疫抑制小鼠IC感染模型,正常对照组注射等量无菌生理盐水。收集感染后8h、Id、2d、3d、5d/、鼠血清和肾匀浆上清(每个时间点5只小鼠),进行Eno和Fba定量检测,同时检测WBC计数、血培养和肾真菌载量,获得Eno和Fba在IC感染中的动力学资料。 4.IC病人血清定量检测Eno和Fba 经血培养和临床症状确诊的IC病人92例,包括白念珠菌46例,近平滑念珠菌15例,热带念珠菌17例,其他念珠菌14例(光滑念珠菌6例、季也蒙念珠菌3例、角膜念珠菌2例、葡萄牙念珠茵1例,希木龙假丝酵母菌2例),收集血清200份,以健康体检者(n=100)、念珠菌定植病人(n=30)血清为阴性对照,定量检测血清Eno和Fba水平,确定cut off值并评估该法在侵袭性念珠菌病诊断中的应用价值。结果 1.Eno抗体的特异性 Western blot结果显示,Eno单抗和多抗能识别白念珠菌胞浆Eno和重组Eno蛋白,Eno单抗与近平滑念珠菌胞浆Eno有交叉反应,Eno多抗与热带念珠菌和近平滑念珠菌胞浆Eno有交叉反应。Fba单抗和多抗能识别白念珠菌胞浆Fba和重组Fba蛋白,与热带念珠菌和近平滑念珠菌胞浆Fba均有交叉反应。 2.定量检测Eno双抗体夹心法ELISA'性能指标 Eno浓度为25ng/ml和5ng/ml时,批内和批间精密度分别为6.72%、7.18%和10.4%和12.68%；最低检测下限为1.25ng/ml;线性范围为(1.25-50) ng/ml;标准品浓度为50ng/ml、25ng/m1和5ng/ml时,血清回收率分别为97.75%、122.84%和92.13%。 3.定量检测Fba双抗体夹心ELISA法性能指标 Fba浓度为50ng/ml和10ng/m1时,批内和批间精密度分别为6.88%、7.45%和9.72%和11.92%。最低检测下限为2.5ng/ml,线性范围为(2.5-100) ng/ml,标准品浓度为100ng/ml、50ng/ml和10ng/ml时,血清回收率分别为104.02%、102.84%和90.90%。 4.体外真菌培养上清Eno和Fba定量检测 37℃培养24h,白念珠菌培养上清中可检出Eno (3.06ng/ml),培养至120h,上清中Eno逐渐增至33.43ng/ml.37℃培养48h,近平滑念珠菌上清可检测出少量Eno (1.03ng/ml),随后一直保持低水平,培养至120h,上清Eno浓度为3.17ng/ml。37℃培养9h,白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠茵培养上清中可检出Fba,浓度分别为2.60ng/ml、1.14ng/ml和2.19ng/ml,培养至120h,白念珠菌培养上清中Fba浓度达54.16ng/ml,热带念珠菌和近平滑念珠菌培养上清Fba呈现相同的缓慢增长趋势,培养至120h,Fba浓度分别达13.60ng/ml和7.82ng/ml o在整个培养过程中,光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母培养上清内未检测出Eno和Fba。25℃培养条件下白念珠茵的菌丝生长弱于37℃,培养上清中Eno和Fba水平始终低于37℃培养上清。说明Eno和Fba水平与白念珠菌菌丝生长呈正相关。 5.IC小鼠中Eno和Fba动力学资料 5.1IC小鼠中血清Eno和Fba阳性率免疫抑制组和免疫正常组小鼠感染后8h均有60%(3/5)存在念珠菌血症。免疫抑制组感染后1d,20%(1/5)小鼠仍有念珠菌血症,感染后2d念珠菌血症消失。免疫正常组小鼠感染后1d念珠菌血症即消失。两组小鼠在整个实验期血清可检出Eno、Fba,免疫正常组Eno阳性率为33.3%-100%,Fba阳性率为75%-100%,免疫抑制组Eno阳性率为50%-100%,Fba阳性率为100%,在每个观察时间点Eno和Fba阳性率均高于同期血培养阳性率,免疫正常组小鼠感染后Id, Fba阳性率显著高于血培养阳性率(P=0.008,P0.05/4),免疫抑制组小鼠感染后3d Eno阳性率、感染后2d、3d和5d Fba阳性率显著高于血培养阳性率(P均=0.008,P0.05/4)。 5.2IC小鼠血清Eno和Fba水平免疫正常组小鼠感染后8h、1d Fba水平[分别为4.56(3.66,34.03)ng/ml和23.76(20.34,41.06) ng/ml]显著高于正常对照组[0(0,0.175) ng/ml](P均=0.008,P0.05/6)。免疫抑制组小鼠感染后1d、3d Eno水平[分别为6.34(0.92,12.45)ng/ml和3.09(1.26,6.48)ng/ml]显著高于正常对照组[0(0,0) ng/ml](P均=0.005,P0.05/6),感染后所有时间点Fba水平均显著高于正常对照组‘(P均=0.008,P0.05/6),差异具有统计学意义。免疫抑制组小鼠外周血Eno和Fba抗原水平高于免疫正常组小鼠,感染后3d,免疫抑制组小鼠Eno水平与免疫正常组之间差别具有统计学意义(P=0.045)。血清Eno和Fba水平之间呈显著正相关(rs=0.363,P=0.018,n=42)。 5.3IC小鼠肾匀浆Eno和Fba水平免疫正常组和免疫抑制组IC小鼠在感染后8h到5d,肾组织匀浆全部可以检出Eno和Fba,反映了肾脏侵袭感染状态；感染后8h及1d,免疫抑制组Eno含量[分别(262.99±92.18) ng/ml和(325.24±117.32) ng/ml]高于免疫正常组[分别(139.24±61.48)ng/ml和(133.82±80.15)ng/ml],差异具有统计学意义(P=0.037和P=0.017)。两组小鼠感染后肾匀浆Eno和Fba含量高于正常对照组,感染后各时间段,免疫抑制组小鼠肾组织匀浆Eno和Fba水平均显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)；感染后5d免疫正常组小鼠肾组织匀浆Fba水平[(999.96±168.78) ng/ml]显著高于正常对照组[(0.38±0.22)ng/ml](P0.01)。感染后各时间点间,两组小鼠肾组织匀浆Eno和Fba水平没有统计学差异。肾组织匀浆Eno和Fba水平之间呈显著正相关(rs=0.623,P=0,n=50)。 6.IC病人血清Eno和Fba定量检测 6.1IC病人血清Eno和Fba定量检测 92例IC病人血清Eno水平为0(0,1.33)ng/ml,血清Fba水平为3.58(0,16.32)ng/ml,显著高于与阴性对照组血清Eno和Fba水平[均为0(0,0)](U值分别3026.5和4312.0,P均=0)。白念珠菌感染患者(n=46)血清Eno和Fba水平最高[分别为0.52(0,3.55) ng/ml和5.53(0,31.31) ng/ml],其次为热带念珠菌感染组(11=17)[分别为0(0,0.39) ng/ml和3.67(0,19.81) ng/ml],再次为近平滑念珠感染组(n=15)[分别为0(0,0.23) ng/ml和0(0,4.69) ng/ml],其他念珠菌感染组(n=14)最低[分别为0(0,0) ng/ml和0(0,3.72)ng/m1]。其他念珠菌感染患者、阴性对照组Eno和Fba水平与白念珠菌感染患者之间差异具有统计学意义(P0.05/5或P0.01/5),阴性对照组Fba水平与近平滑念珠菌感染患者、热带念珠菌感染患者之间差异具有显著性(P0.05/5或P0.01/5)。Eno、Fba对侵袭性念珠菌感染诊断的敏感性分别为33.70%(31/92)和53.26%(49/92),两者差异具有统计学意义(P=0.003)。Eno在不同念珠菌侵袭感染病人中的阳性率均低于Fba,但两者之间未见统计学差异。Spearman相关分析显示,侵袭性念珠菌感染病人200份血样中Eno和Fba水平之间呈显著正相关(rs=0.489,P=0,n=200)。 6.2侵袭性白念珠菌感染病人血清Eno和Fba定量检测 Eno检测对侵袭性白念珠茵感染的敏感性为52.17%(24/46),对非白念珠菌侵袭感染的敏感性为13.04%(6/46),两者之间差异具有极显著性(x2=16.026,P=0)；Fba检测对侵袭性白念珠菌感染的敏感性为69.57%(32/46),对非白念珠菌侵袭感染的敏感性为34.78%(16/46),前者显著高于后者(x2=11.152,P=0.001)。Eno与Fba定量检测对侵袭性白念珠菌感染的敏感性、特异性和AUC分别为52.17%、99.23%、0.729和69.57%、99.23%、0.839,两者联合检测敏感性上升为80.43%。Eno与Fba定量检测阳性结果可以早于血培养阳性结果。增加检测频次有助于提高IC的检出率。结论 1.利用单克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的多克隆抗体作为检测抗体,重组蛋白作为标准品,建立了定量检测Eno和Fba的双抗体夹心ELISA法。通过对性能指标的评价,定量检测Eno和Fba双抗体夹心ELISA方法的特异性、精密度、血清回收率均能满足临床应用的要求,检测灵敏度与文献报道较为一致。 2.建立的定量检测双抗体夹心ELISA方法可特异性检出白念珠菌培养过程中产生的天然Eno和Fba,培养上清中的Eno和Fba水平与菌丝生长状态呈正相关。Eno定量检测与近平滑念珠菌,Fba定量检测与热带念珠菌、近平滑念珠菌有微弱交叉反应。双抗体夹心ELISA方法与光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母培养上清中Eno和Fba无交叉反应。 3.建立了IC感染的免疫正常组和免疫抑制组小鼠模型,首次获得Eno和Fba在IC进程中的动力学资料。感染后8h到5d,两组小鼠肾组织匀浆全部可以检出Eno和Fba,反映了肾脏侵袭感染状态；两组小鼠在整个实验期血清Eno和Fba阳性率均高于同期血培养阳性率。血清Eno和Fba水平之间、肾组织匀浆Eno和Fba水平之间呈显著正相关。免疫抑制组小鼠血清、肾组织匀浆Eno和Fba水平高于免疫正常组小鼠,提示Eno和Fba可以作为侵袭性念珠菌感染的诊断标志物。 4.首次评价了Eno和Fba定量检测对IC的诊断价值,发现Eno和Fba定量检测对侵袭性白念珠菌感染病人的诊断价值高于念珠菌属感染的IC病人。Eno与Fba定量检测对侵袭性白念珠菌感染的敏感性和特异性分别为52.17%、99.23%和69.57%、99.23%,两者联合检测敏感性上升为80.43%,证实Eno与Fba是有潜力的IC诊断标志物。Eno与Fba定量检测阳性结果可以早于血培养阳性结果,可用于早期诊断侵袭性白念珠菌感染,是血培养方法的有益补充。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R519.3

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