细粒棘球绦虫成虫基因表达谱分析及抗包虫药物筛选

发布时间：2018-04-18 09:18

本文选题：包虫病 + 己糖激酶　；参考：《兰州大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景：包虫病(Echinococcosis)是由棘球绦虫(Echinococcus)后绦幼虫棘球蚴寄生于人体或宿主动物而引起的严重疾病。我国是包虫病发病率较高的国家,同时有囊型和泡型两种类型的包虫病。阿苯达唑是目前临床应用最广泛的抗包虫病药物,但是该药肠道吸收率差,其只能抑制寄生虫生长,而不能有效杀灭寄生虫,患者必须长期大量服用该药物才能达到治疗效果。临床研究发现其平均治愈率仅有30%,并且该药可引起多系统的严重药物不良反应(serious adverse drug reactions, SADR),如脑炎综合征(急性脱髓鞘脑炎)、消化功能紊乱、急性肝损伤、癫痫、溶血性贫血、肾衰、过敏性休克、严重药疹等。另外,持续几十年的使用,包虫对阿苯达唑产生耐药性的问题也愈来愈严重。因此,寻找或开发疗效显著且副作用小的包虫病治疗新药物具有重大的意义,是当务之急。新的治疗药物的研制有赖于对寄生虫虫体生物学的全面解析。目前,细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, E.granulosus)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, E.multilocularis)全基因组测序工作已经完成,另外Genbank (NCBI)数据库中亦包含了多条来源于E.granulosus和E.multilocularis原头节和生发层组织的表达序列标签(Expressed Squence Tag, EST)。包虫基因组学和功能基因组研究为完全解析虫体的生物学特性奠定了基础,同时也加快了寻找或开发新的抗包虫病药物的进程。在包虫生活史中,通过人为阻断或抑制虫卵入侵至虫卵成熟之间的任何发育阶段,都具有控制或减轻病情和阻断传播的实际意义,包虫生活史的各个阶段,如虫卵、幼虫、成虫等均可作为包虫病药物作用的靶标。吕刚等人构建了E.granulosus成虫全长cDNA质粒文库,这为开展对E.granulosus成虫阶段基因的研究和筛选、分离、鉴定E.granulosus生长发育关键分子及潜在药物靶点奠定了基础。研究方法：对己成功构建的E.granulosus成虫全长cDNA质粒文库进行大规模5'EST随机消减测序,注释所获得的高通量数据,对EST进行功能分类及代谢途径分析,在已有的包虫功能基因组学研究基础上,分析E.granulosus生长发育关键分子及潜在药物靶点。结合已有物种糖酵解及磷酸戊糖代谢途径相关基因的研究现状,筛选E.granulosus中参与该两条代谢途径的部分重要基因。通过生物信息学技术分析所获得的E.granulosus糖酵解关键酶-己糖激酶(Hexokinase,EgHK)和磷酸戊糖途径关键酶-转醛醇酶(Transaldolase,瀛TAL)的全长基因及其编码蛋白的结构和功能特点。利用分子生物学技术构建BL21-pET30a-EgTAL和BL21-pET30a-EgHK原核表达质粒,进行蛋白的诱导、表达及纯化,研究其酶学特性。将纯化EgHK和EgTAL蛋白免疫BALB/c小鼠以获得特异性多克隆抗体,通过western-blot方法鉴定蛋白,并采用免疫组织化学染色对EgHK和TAL在细粒棘球蚴组织的表达进行定位分析。在以上研究基础上,选取多种糖酵解途径酶抑制剂,如3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate)、氯尼达明(Lonidamine)、2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose)、氯舒隆(Clorsulon)、2,6-二羟基萘(2,6-dihydroxynaphthalene)、草氨酸钠(Sodium oxamate)、6-氨基烟酰胺(6-aminonicotinamide)、奥硝唑(Ornidazole)以及磷酸戊糖代谢途径抑制剂羟基硫胺素(Oxythiamine chloride hydrochloride),同时选取中药蛇葡萄素,进行体外实验研究其抗细粒棘球蚴和泡球蚴的作用。建立小鼠泡球蚴感染模型,连续六周口服给予小鼠3-溴丙酮酸治疗,评价其抗泡球蚴效果。通过体外培养人正常肝细胞,利用MTT比色法分析比较3-溴丙酮酸、蛇葡萄素以及阿苯达唑对人正常肝细胞的毒性作用。另外以BALB/c小鼠为模型,口服给予有效抗包虫治疗剂量的3-溴丙酮酸和阿苯达唑六周后,通过检测肝肾功能生化指标以及组织病理镜检分析其对小鼠正常肝脏和肾脏的不利影响。研究结果：本研究从E.granulosus成虫全长cDNA质粒文库中随机挑选克隆进行测序,共得到了1560条unigenes,与NCBI的数据库进行比较,发现了155条E.granulosus特有的新基因。将Unigenes利用国际标准分类体系Gene Ontology (GO)进行分类后,其中所占比例最高的是“结合活性”(Binding)和“催化活性”(Catalytic activity),分别为23.33%和3.45%。将Unigenes经过KEGG注释,发现了227条代谢途径,分析可见糖酵解途径的基因表达丰度较高,提示该途径中的基因可能作为潜在的抗包虫药物靶点。生物信息学分析预测表明EgHK和EgTAL有一系列重要的药靶特征。在大肠杆菌表达系统中,EgHK和EgTAL分别以包涵体和可溶性形式表达,经过Ni离子亲和层析柱得到了高纯度的蛋白。用纯化的EgHK和EgTAL免疫BALB/c小鼠获得了较高滴度的多克隆抗体,Western-blot鉴定表明重组蛋白EgHK和瀛TAL具有免疫原性和免疫反应性。免疫组织化学定位显示EgTAL及EgHK在原头节及囊壁组织均广泛表达。在众多的糖酵解抑制剂当中,己糖激酶抑制剂3-溴丙酮酸抗细粒棘球蚴和多房棘球蚴的作用效果最强,在作用浓度为40μM时,其作用强于阿苯达唑(P0.05)。3-溴丙酮酸通过口服途径治疗泡球蚴感染小鼠有明显的治疗效果,与未治疗组相比,泡球蚴组织囊块湿重明显减轻(P0.05)。不同浓度的3-溴丙酮酸能够不同程度的抑制重组EgHK蛋白的催化活性,表明3-溴丙酮酸是通过抑制E.granulosus的HK而发挥抗包虫作用的。中药蛇葡萄素也显示了较好的抗包虫作用,浓度为160μM时,作用7天后原头节存活率为1.5%,该作用效果与40μM阿苯达唑相当。蛇葡萄素浓度为400μM、800μM、1000μM时,抗泡球蚴作用明显强于40μM阿苯达唑(p0.05)。MTT实验结果显示3-溴丙酮酸和蛇葡萄素对人正常肝细胞均有毒性作用,在有效抗泡球蚴作用浓度下,阿苯达唑对肝细胞的毒性作用最大,3-溴丙酮酸和蛇葡萄素的毒性作用小于阿苯达唑。BALB/c小鼠体内毒性实验表明3-溴丙酮酸和阿苯达唑在有效抗泡球蚴作用浓度下对肾脏功能无明显影响,阿苯达唑可引起较严重的肝组织损伤,血清中碱性磷酸酶(ALP)和谷丙转氨酶(ALT)含量升高,谷草转氨酶(AST)含量为148.000士27.475U/L,显著高于正常对照组AST值(115.500±18.355U/L)(P0.05),病理组织镜检呈慢性肝炎样变,而3-溴丙酮酸则未引起明显的肝脏损伤。结论：本研究首次完成了对E.granulosus成虫cDNA文库EST的分析,丰富并发展了E.granulosus基因组学的研究,为寻找或开发抗E.granulosus新药物奠定了基础。通过对E.granulosus基因组信息的挖掘,研究了其高丰度表达基因EgHK和EgTAL及其编码蛋白的特性,揭示了其作为潜在药物靶标的可能性。在此基础上,选取多种糖酵解以及磷酸戊糖途径抑制剂,同时选取中药蛇葡萄素,通过体外和体内实验评价其抗包虫效果。糖酵解酶HK抑制剂3-溴丙酮酸和蛇葡萄素具有较好的抗棘球蚴和泡球蚴作用,并且初步研究表明3-溴丙酮酸毒副作用小于阿苯达唑,3-溴丙酮酸和蛇葡萄素有望成为抗包虫候选新药物。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R532.32

【参考文献】