HIV-1耐药与宿主遗传因素的相关性研究

发布时间：2018-04-19 07:24

本文选题：人类免疫缺陷病毒 + 亚型　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2014年博士论文

【摘要】：人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原体，能够引起以全身免疫系统严重损坏为特征的传染性疾病，近30年来在全球肆虐流行，给人类的生命安全、经济发展和社会进步造成了十分严重的危害，已经引起了各国政府和社会的普遍关注[1]。高效抗逆转录病毒疗法（highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART）能够有效地抑制HIV-1感染者体内病毒的复制，延长寿命并提高生活质量。然而HIV-1耐药的出现极大地削弱了HAART的疗效，并已成为抗病毒治疗失败的主要原因。HIV-1耐药的产生是宿主、病毒和抗病毒药物共同作用的结果。我国自2004年开展HIV耐药研究以来，研究工作主要围绕耐药毒株发生和进化规律、耐药毒株检测方法等展开，尚未有我国人群遗传因素与HIV-1耐药关系的研究。本课题首先对我国部分地区接受抗病毒治疗的艾滋病患者中HIV-1耐药毒株流行的状况进行了横断面研究，然后分析了我国流行的主要HIV-1毒株耐药突变位点亚型间的分布差异，在掌握耐药毒株流行状况的基础上，对我国HIV- 1感染人群体内参与抗病毒药物吸收、分布、代谢及排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）的一系列酶和蛋白编码基因的多态性情况及其与HIV-1耐药发生的关系进行了系统、深入的研究，旨在为临床制定延缓病毒耐药产生的方法和策略、实现个体化治疗、确保抗病毒治疗效果及为实现我国有限的抗HIV药物资源的长期、可持续应用奠定理论基础。第一部分：我国部分地区HIV-1感染者耐药现状研究为了解和掌握我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中HIV-1耐药毒株的流行状况，采用基于扩增测序的经典HIV-1基因型耐药检测方法，对河北省、山西省及北京协和医院收治的共322例艾滋病患者进行了基因型耐药检测，分析了人群耐药情况及与耐药发生相关的因素。主要结果如下： 1.322例艾滋病患者的耐药率为46.5%，河北、山西及北京协和医院患者的耐药率分别为50.0%、56.5%和14.7%，地区差异显著（Fisher’sexacttest,p0.05）。 2.不同地区样本耐药突变位点的分布无显著性差异，常见耐药突变位点均为M41L、D67N、K70R、K101E、K103N、Y181C、M184V、G190A、T215F及T215Y，其中K103N、Y181C和M184V分布频率最高，分别为17.5%、12.9%和29.0%。 3.抗病毒药物耐药率依次为NVP46.2%、3TC32.8%、EFV30.1%、d4T20.7%、AZT12.2%、TDF5.9%，存在严重的交叉耐药导致对一些未曾使用过的药物耐药，如ABC、RPV和ETR耐药率分别达到33.2%、24.4%、22.6%。 4.统计学分析显示HIV-1的感染途径对耐药程度具有显著影响（性传播：敏感55.4%、潜在耐药5.0%、低度耐药2.5%、中度耐药1.7%、高度耐药35.5%；血液传播：敏感38.3%、潜在耐药5.0%、高度耐药56.7%，Kruskal-Wallistest,p0.05）；性别（男：D67N4.6%、Y181C9.3%、M184V23.2%、G190A7.3%，女：D67N1.7%、Y181C23.3%、M184V41.7%、G190A11.7%）和感染途径（性传播：M41L1.7%、K103N14.9%、Y181C8.3%、T215F/Y4.2%，血液传播：M41L13.3%、K103N25.0%、Y181C20.0%、T215F/Y15.0%）对耐药突变类型的影响具有统计学意义（Multinomial Logistic Regression, p0.05）。第二部分：我国流行HIV-1毒株不同亚型间耐药突变位点的差异分析 HIV-1具有高度的变异性，可分为M、N、O及P4个群，其中M群包含9个亚型、55个流行重组型（circulating recombinant form, CRF）以及难以计数的独特重组型（uniquerecombinantform,URF），各个变异毒株的基础基因序列不同，在药物压力下耐药选择和发生的路径及难易程度也各不相同。目前几乎所有抗病毒药物的耐药数据都是基于B亚型而获得的，而我国流行的主要HIV-1毒株是CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型。为了解我国HIV-1主要流行毒株耐药突变位点的分布差异，为优化临床治疗方案、提高抗病毒治疗效果提供指导，我们以5442条HIV-1pol区基因序列（按照来源分，本实验室积累1483条、云南省艾滋病关爱中心提供335条、自HIV sequence database下载3624条；按照亚型分，CRF01_AE序列1696条、CRF07_BC序列502条、CRF08_BC序列924条和B亚型序列1984条）作为研究对象，分析了HIV-1不同亚型间pol区基因耐药突变位点的氨基酸分布差异及其原因。主要结果如下： 1.不同亚型病毒间逆转录酶（RT）区19个耐药突变位点的氨基酸分布存在显著差异（chi-square test, p0.05），发生频率占前5位的突变分别是：B亚型毒株，103、215、181、184、190；CRF01_AE，238、184、190、181、103；CRF08_BC，184、103、69、181、101/190。蛋白酶（PR）区17个耐药突变位点的氨基酸分布存在显著差异，发生频率占前5位的突变分别是：B亚型毒株，89、63、77、93、35；CRF01_AE，89、36、35、93、63； CRF07_BC，63、89、93、35、77；CRF08_BC，93、36、63、89、82。 2. B亚型、CRF01_AE和CRF08_BC毒株逆转录酶（RT）区5个耐药突变位点（69、138、181、215和238）的氨基酸由野生型转变为耐药型所需核苷酸突变的种类和数量即基因屏障存在显著差异（Kruskal-Wallistest,p0.05），提示亚型对耐药突变的产生具有一定的影响。 3.大部分耐药突变位点是在各亚型序列多态性位点的基础上发生的，多态性位点在抗病毒药物的选择下易发生耐药突变。 4.不同亚型病毒中分布频率最高的耐药突变位点（20%）均为K103、Y181和M184，偏嗜耐药突变位点（10%）基本一致，且B亚型毒株中的耐药突变均存在于其他非B亚型毒株中。 5.目前人群水平上HIV-1不同亚型病毒的治疗方案及耐药突变位点的偏嗜情况基本一致，因此推断针对B亚型设计的抗病毒药物及治疗方案同样适用于包括CRF01_AE、CRF07_BC及CRF08_BC等在内的其他非B亚型病毒。第三部分：宿主基因多态性与HIV-1耐药的相关性研究 HIV-1耐药是病毒、宿主和抗病毒药物共同作用的结果。宿主参与抗HIV药物吸收、分布、代谢及排泄的一系列酶或蛋白编码基因上的单核苷酸多态性位点（singlenucleotidepolymorphismsite,SNPs），能够影响抗HIV药物的药代动力学和/或药效学，进而影响血浆药物浓度及药物选择压力，导致不能形成和/或维持对病毒的有效抑制，从而出现耐药。分析并阐明宿主基因多态性与HIV-1耐药的关系，可以为临床上延缓HIV-1耐药的发生、优化抗病毒治疗方案乃至个体化治疗提供理论依据和技术支持。目前，国外相关研究大多集中或者局限于药物药代动力学和/或药效学的改变，且多为单一基因或针对单一药物的研究，，未见宿主基因多态性与HIV-1耐药相关性的研究报道。在本研究中，首先采用PCR扩增和测序的方法检测了与常用抗病毒药物代谢密切相关的CYP（2B6、2C9及3A4）基因的SNPs在129例艾滋病患者体内的存在、分布情况，并对其与HIV-1耐药的关系进行了分析；其次建立了检测人体47个参与抗HIV药物吸收、分布、代谢及排泄的一系列酶或蛋白编码基因上SNPs的MassARRAY方法，然后检测了这些SNPs在810例具有良好服药依从性的艾滋病患者（北京协和医院475例、云南省艾滋病关爱中心335例）中的分布情况，并测定了153例艾滋病患者NVP的血浆药物浓度，结合临床资料，对这些SNPs与HIV-1耐药发生的相关性进行了深入分析。主要研究结果如下： 1.成功构建了CYP（2B6、2C9及3A4）基因外显子区域及外显子-内含子结合部SNPs的检测方法，共检测SNPs70个，其中分布频率5%的SNPs17个，大部分位点为NCBISNPdb或Hapmap所收录且分布于内含子区域，CYP2C9g.10417和CYP3A4g.20446为新鉴定多态性位点。 2.通过文献阅读、资料分析，结合我国使用的抗HIV药物，确定了47个人体参与抗HIV药物吸收、分布、代谢及排泄的酶或蛋白编码基因上的SNPs，主要集中在细胞色素P450基因和ABC家族基因上。 3.设计了141条引物（47对扩增引物，47条延伸引物），建立并优化了检测47个SNPs等位基因碱基类型的MassARRAY方法，完成了810例接受抗病毒治疗的艾滋病患者标本（敏感标本600份vs.耐药标本210份）的检测，首次获得了47个SNPs在我国HIV-1感染/艾滋病人群中分布的数据，rs3892097（0.012vs.0.106）、rs12248560（0.012vs.0.152）、rs2740574（0.002vs.0.202）及rs7439366（0.004vs.0.126）等4个位点的等位基因分布与国外研究结果存在较大差异。 4.单因素分析显示rs8192726、rs3745274、rs2279343、rs4646437、rs776746、rs17222723、rs899494、rs2274407、rs2231142、rs2231137及rs9264942等11个SNPs在抗病毒治疗敏感-耐药人群间的等位基因分布存在显著差异（Fisher’sexacttest,p0.05）；多因素分析显示rs2779343、rs776746、rs9264942及基线病毒载量等因素与HIV-1耐药的产生存在显著相关性（BinaryLogisticanalysis,p0.05），其中rs2779343AG/GG、rs776746GG、rs9264942TT及基线高病毒载量为耐药发生的危险因素，OR分别为3.536/4.283、2.141、1.316和3.038，值得深入研究。 5.完成153份标本的血浆药物浓度的检测，并分析了血浆药物浓度与HIV-1耐药的关系。第四部分：宿主BST-2基因与HIV-1Vpu基因多态性的相关性研究宿主BST-2基因编码的黏合素蛋白是近年来发现的一种抗病毒蛋白，是人体细胞内天然免疫机制的重要组成部分，能够有效地抑制体内HIV-1Vpu缺陷病毒的复制。Vpu蛋白是HIV-1克服黏合素抗病毒作用的关键蛋白，能够有效对抗黏合素蛋白的抗病毒作用，保证HIV-1复制的正常进行。阐明BST-2基因多态性并分析其与HIV-1Vpu基因多态性间的关系，有助于深入理解HIV-1的致病机制。主要研究结果如下： 1.建立了宿主BST-2基因多态性的检测方法，检测到13个高频SNPs，其中9个为NCBI SNPdb或Hapmap所收录，4个为新鉴定位点，并对这些SNPs的分布及连锁情况进行了分析。 2.建立了检测上述13个SNPs等位基因的MassARRAY方法，并完成810例样本的检测。 3.建立了HIV-1Vpu基因的扩增方法，成功获得413条序列，分析显示不同亚型间Vpu基因氨基酸分布存在较大差异，且60%以上位点为多态性位点。 4. BST-2基因多态性对HIV-1Vpu基因的多态性情况具有显著影响（Fisher’sexacttest,p0.05）；HIV-1Vpu基因多态性与病毒载量显著相关（spearman’srho test, p0.05），与Vpu蛋白促进病毒颗粒释放的功能相吻合。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.91

【参考文献】