弓形虫感染后宿主细胞的磷酸化蛋白质组学研究

发布时间：2018-05-30 03:32

本文选题：弓形虫 + 宿主细胞　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：一.研究背景刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的原虫,几乎可以感染温血动物的所有有核细胞,其终宿主为猫,而中间宿主从人类到鸟类分布极其广泛。它是引起人兽共患的弓形虫病的病原体,全球约有三分之一的人口隐性感染了弓形虫。弓形虫是一类机会性的致病原虫,免疫机能正常的个体感染弓形虫后可由急性感染转为隐性感染,因而大多数感染者未表现出明显的临床症状；而对于免疫功能低下的个体,如器官移植患者、艾滋病人等,感染弓形虫后弓形虫则可在其体内发生快速增殖进而引起严重的组织损伤及相应的临床症状,如脑炎、弓形虫眼病、淋巴结炎等,严重者甚至危及生命。妇女孕期感染弓形虫后弓形虫可通过胎盘传给胎儿,进而导致流产、死胎、畸胎和新生儿弓形虫病的发生。弓形虫入侵宿主细胞机制及其与宿主细胞间的相互作用机制目前已被广泛研究。它入侵宿主细胞后寄居于一个非融合小室——纳虫泡(parasitophorous vacuole)内,纳虫泡膜为弓形虫免受宿主细胞清除提供了保护屏障,弓形虫在纳虫泡内依靠宿主细胞提供的营养物质迅速增长繁殖并破坏宿主细胞,最终从已遭破坏的宿主细胞中逸出并立即侵入邻近的细胞,如此往复。在弓形虫入侵、寄居、破坏及离开宿主细胞这一过程中,宿主细胞内部的细胞信号转导网络发生了广泛的变化。磷酸化/去磷酸化是蛋白翻译后修饰的重要方式之一,蛋白的磷酸化/去磷酸化的发生往往伴随着蛋白活性的获得或失去,而这一过程主要依靠蛋白激酶(Protein kinase, PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝/苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯以及蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase, PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而完成。由于这一过程伴随着蛋白活性的改变,生物体内蛋白的磷酸化/去磷酸化扮演着分子开关的作用,普遍地参与到了细胞各个生物学过程的细胞信号转导的调控中。正因为蛋白磷酸化/去磷酸化是细胞生命活动的调控中心且在细胞信号传递过程中广泛存在并担负着重要作用,因此本次研究以弓形虫入侵之后的宿主细胞磷酸化蛋白质组学为切入点,研究了弓形虫入侵这一事件对宿主细胞的各细胞信号转导网络的综合影响情况。目前对于弓形虫和宿主细胞之间相互作用的研究,主要研究方向有基因组测序及基因芯片分析,在蛋白水平上也有针对感染后宿主细胞的蛋白质组定量分析的相关研究,而从翻译后磷酸化修饰水平方面进行的研究目前主要集中在以下几方面：针对弓形虫抗凋亡机制的研究；弓形虫感染后炎症信号转导机制的研究；弓形虫自身ROP蛋白与弓形虫毒力的关系以及其与宿主细胞蛋白相互作用的研究等。但这些针对蛋白磷酸化水平的研究都较为局限和分散,原因之一可归结于技术水平所限导致难以实验对磷酸化蛋白质组进行高通量的有效的分析。近些年来SILAC技术的发展及其与高效反向液相色谱-质谱联用技术的联合使用使得高通量分析磷酸化蛋白质组学成为可能。SILAC (Stable isotope labeling with amino acid in cell culture)即细胞培养条件下稳定同位素标记技术。其原理为分别用含有轻、中、重型同位素标记的必须氨基酸的培养基培养细胞,则新合成的蛋白质含有不同重量的同一种氨基酸,培养一定代数后几乎所有的蛋白均被同位素标记上。不同组的蛋白等量混合后进行胰酶酶切处理,酶解后的肽段进段进行液相分离,之后上质谱分析,一级质谱图中不同组的同种肽段会呈现出肽段群,通过比较同位素肽段群的峰面积大小进行相对定量。一级质谱中的磷酸化肽段的鉴定是通过与肽段理论值进行比较,相差80Da (HPO3=80Da)的质谱峰被选入进行二级质谱分析,肽段破碎出现98Da的中性丢失则可进一步确定其发生了磷酸化,同时亦可测定出中性丢失的位点即确定磷酸化发生的位点。二级谱图对肽段进行序列测定结合数据库的搜索从而对蛋白进行鉴定。磷酸化蛋白质组学研究过程中的另一个技术难点则是对磷酸化蛋白进行富集,近些年来金属氧化物亲和富集技术引起了越来越多研究者的关注。Ti02与磷酸肽上磷酸基团具有高度的亲和能力,在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于先前较为流行的IMAC(固相金属亲和色谱)技术,故本次研究选用了Ti02柱来完成了对磷酸化肽段的富集。以上技术使得在本次研究中完成对宿主细胞磷酸化蛋白的富集及精确的定量分析成为了可能。二.研究目的弓形虫入侵宿主细胞是一个涉及到吸附、伴随着纳虫泡的形成入侵到细胞内、汲取宿主细胞营养完成自身生长及繁殖和逸出旧宿主细胞侵染邻近新宿主细胞这样一个连续的过程。这一过程不同的时间点对宿主细胞的影响侧重点有所不同,如其感染宿主细胞早期可表现出宿主细胞抗凋亡的作用,而在感染晚期则往往导致了宿主细胞的崩解和死亡。为了研究弓形虫感染宿主细胞早期和晚期宿主细胞内细胞信号网络的各自变化情况,本次研究分别设置了对照组(无弓形虫感染)、早期感染组(弓形虫侵染2小时)和晚期感染组(弓形虫感染6小时),来对比分析弓形虫侵染宿主细胞这一事件在感染早期和晚期对宿主细胞细胞信号转导的影响分别侧重于哪些细胞生物进程。三.研究方法1.用SILAC对HFFs细胞蛋白进行标记本研究采用碳元素同位素12C和13C以及氮元素的同位素14N和15N进行精氨酸和赖氨酸的标记。L组为L-Lysine-2HCL和L-Arginine-HCL, M组为13C6L-Arginine-HCL和13C6L-Lysine-2HCL,H组为13C615N2 L-Lysine-2HCL和13C615N4 L-Arginine-HCL。HFF细胞分别用此三种培养基进行细胞培养,培养六代以后,每组获得八个大平皿的细胞,收集两个大平皿(D15)细胞送检标记率。标记率检测结果合格,至此细胞标记完成。2.样品的制备收集体外细胞培养所得的RH株弓形虫速殖子,按照10：1的比例平均加入到H组和M组各自的六个平皿中。M组侵染2小时后停止侵染,收集细胞。H组侵染2小时后,洗脱游离细胞外的弓形虫,继续加入SILAC-H培养基让细胞内的弓形虫继续侵染4小时,之后停止侵染,收集细胞。L组细胞不被弓形虫侵染,直接收集细胞。3.磷酸化肽段的分离、富集及质谱分析提取各组细胞的总蛋白后取三组细胞的蛋白进行1：1：1等量混合,用Trypsin Gold (protein:trpsin=20:1)37℃消化4小时后,按同样比例再加入Trypsin Gold继续无间断消化8小时。酶解后所得的肽段利用阳离子交换液相色谱柱SCX进行分离,将所得到的不同馏分过Ti02柱进行磷酸化肽段的富集。之后再将分离开的磷酸化及非磷酸化肽段上NanoLC-MS/MS Plateform及Triple TOF 5600 System质谱联用进行分析。4.质谱信息的数据库的搜索选取IPI human(91464 sequences)和ToxoDB-release-9.0数据库,利用ProteinPilot v4.0对所得质谱数据进行搜索及鉴定。对所鉴定出的磷酸化肽段、磷酸化蛋白信息,利用David Bioinformatics Resources, STRING (version 9.1), Molecule Annotation System,及Cytoscape等生物信息学软件做进一步的生物信息学分析。四.实验结果1.蛋白鉴定结果本次实验共鉴定出5593条肽段,其中3415条发生了磷酸化,共有2020个磷酸化位点；共鉴定到1293个宿主蛋白,其中发生磷酸化的蛋白数为967个。2020个磷酸化位点中有1869个发生在丝氨酸上,149个发生在苏氨酸上,2个发生在酪氨酸上。2.不同实验组的定量蛋白比较将本次实验中差异倍数大于1.5且p-value小于等于0.05的磷酸化肽段定义为显著差异磷酸化肽段。本次实验测得M组对比L组中,总共有450个显著差异性的磷酸化肽段,其中267个磷酸化水平上调,183个磷酸化水平下调,总共对应到301个磷酸化蛋白上；H组对比L组中,总共测得354个显著差异性磷酸化肽段,其中193个磷酸化水平上调,161个磷酸化水平下调,总共对应到249个磷酸化蛋白上；H组对比M组共检测到425个显著差异性磷酸化肽段,其中181个磷酸化水平上调244个磷酸化水平下调,总共对应到288个磷酸化蛋白上。3.对所鉴定到的蛋白进行生物信息学分析对所鉴定到的967个磷酸化蛋白统一做GO分析以及将三组两两比较所得的显著差异性蛋白分别做GO分析可发现,这些蛋白在生物学过程上排首位的为细胞进程(cellular process)、在细胞组分上排首位的为细胞组分(cell part)、分子功能上排首位的为结合(binding)。从三组数据比较所得细胞组件的GO富集信息来看,M/L特异性富集在细胞核(pore complex; nuclear envelope)相关上,H/M组特异性富集在线粒体(mitochondrial part; mitochondrial envelope; mitochondrial membrane)、细胞核(nucleoplasm)及细胞骨架(intermediate filament)上,H/L组特异性富集在细胞骨架(cytoskeleton part; cell cortex; microtubule cytoskeleton)上；分子功能的GO术语在M/L组中未出现特异性的富集,H/M组特异性的富集在酶结合(enzyme binding)上,H/L组则特异性富集在细胞骨架结合(actin filament binding)上；生物学过程方面,M/L组未出现特异性的富集,H/M组特异性富集在RNA剪接(nuclear mRNA splicing, via splicesome; RNA slicing, via transesterification reaction; RNA Splicing,viatransesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile)及细胞骨架调节(cytoskeleton organization)上,H/L组特异性富集在细胞骨架调节(regulation of cytoskeleton organization; negative regulation of cytoskeleton organization; regulation of Microtubule-based process) 及转录 (regulation of transcription factor activity; negative regulation of transcription factor activity)相关上。对于蛋白进行COG分析可得,对于三组对比的特异性蛋白而言,所占比例最高的分类为R类(General function prediction only);对H/L而言,排名第二的为L类(Replication, recombination and repai),紧跟着K类(Transciption)和T类(Signal transduction mechanisms);对于M/L而言排名第二的COG为K类(Transcription),紧跟着的为L类(Replication, recombination and repair);而对于H/M而言,排名第二的为L类(Replication, recombination and repair)和T类(Signal transduction mechanisms),紧跟着K类(Transciption)。H/L组的磷酸化显著差异性蛋白中没有Ⅰ类(Lipid transport and metabolism)蛋白；而在M/L组的磷酸化显著差异性蛋白中没有N类(Cell motility)蛋白；在H/M组中,则没有F类(Nucleotide transport and metabolism)和H类(Coenzyme transport and metabolism)蛋白。对所鉴定到的蛋白做KEGG分析,M/L的磷酸化显著差异性蛋白总共参与到了97个通路中,其中P值0.05的通路有21个；H/L磷酸化显著差异蛋白总共参与到了87个通路中,其中P值0.05的通路有14个；KEGG分析显示,H/M磷酸化显著差异性蛋白总共参与到了95个通路中,其中P值0.05的通路有18个。对比以上三组间比较的KEGG分析,在三组对比中均出现的KEGG过程有细胞周期、DNA复制、内吞作用、黏着斑、缝隙连接、MAPK细胞信号转导、Notch细胞信号转导、核苷酸剪切修复、细胞骨架肌动蛋白调节和剪接体。最后利用MAS3.0及Cytoscape等软件对各组显著差异性蛋白做了蛋白与蛋白相互作用的网络图及蛋白-通路网络图。五.讨论本研究通过胞培养条件下稳定同位素标记技术成功地对HFFs细胞进行了同位素标记,利用SILAC技术联合高效反向液相色谱—质谱联用技术成功地对不同处理后的宿主细胞进行了磷酸化蛋白的分离和高通量的鉴定,成功地鉴定到各组中的磷酸化蛋白、磷酸化肽段及磷酸化位点。通过各种生物信息学分析软件对数据进行分析后,成功地对这些蛋白所参与到的KEGG通路、COG分类、其参加的生物学过程、分子功能及细胞定位进行了分析和归纳总结,通过对比不同处理组间的结果,对弓形虫感染细胞早期和晚期其对宿主细胞信号转导所带来的不同影响提供了初步的提示信息。对鉴定到的蛋白所进行的蛋白相互作用网络分析则为后续的相关研究者提供了一定的实验基础。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R531.8

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