中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究

发布时间：2018-08-30 09:10

【摘要】：研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后进展为肝硬化,甚至肝癌。目前全球约有1.8亿人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防及特异性的抗病毒药物,迄今HCV感染仍是全球严重的公共卫生问题之一。HCV是单股正链RNA病毒,由于复制所依赖的多聚酶缺乏校对功能,HCV基因序列易发生突变,从而呈现一定的异质性。HCV基因型和亚型的区分是根据基因组核苷酸序列的差异程度,前者的序列差异度为30-35%,后者为20-25%。目前,HCV可分为6种基因型和80多种基因亚型。HCV基因型的分布具有明显的地域和人种分布特征。但HCV基因型的分布并非一成不变的,随着HCV传播方式的改变以及全球人口的迁移和流动以及,各地区的HCV基因型分布也在发生变化。有研究表明在一些国家如法国、意大利、波兰、德国等国家HCV基因型分布正在发生变化。随着我国经济的迅猛发展,国内外及国内不同地区之间在各个领域的交流增多,人口流动性增强,这为HCV在人群中快速传播流行提供了环境。在我国1993年对献血者实施HCV抗体筛查之后,丙肝的传播途径也由原来以输血传播为主到以输血、吸毒、纹身、性传播等多种途径并存的现象。HCV的传播方式的改变以及人口的大规模流动,使我国HCV基因型的分布也在发生改变。我国主要HCV基因亚型为1b亚型,其次为2a亚型,北方地区2a亚型患者比例比南方地区高。华南地区1997-2002年间研究报道的HCV 1b亚型的流行率是90%左右,2a亚型是8%左右,未见6a亚型报道。2005年Lu等调查发现,华南地区珠三角三城市66例样本中1b亚型的比例为66.7%,6a亚型所占比例21.2%,已超过2a亚型的比例(7.6%)成为仅次于1b亚型的第二大基因型。但是因为研究样本量较少,结论需要进一步证实。影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒因素包括HCV基因型、病毒Core和NS5A区突变、治疗前病毒载量等因素。现已公认,HCV基因型与临床抗病毒治疗疗效及疗程有关联。2004年我国发布的《丙型肝炎防治指南》和2009年美国肝病研究协会(AASLD)的《丙型肝炎的临床实践指南》(更新版)中均明确指出：1型的持续病毒学应答比2、3型低；推荐1型的治疗疗程为48周,而非1型(2/3型)的疗程为24周,1型和非1型患者的利巴韦林的剂量也不同。由此可见,HCV基因型对指导慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗具有重要的临床意义。由于HCV 6型分布地区较为局限,关于该基因型的抗病毒治疗结局和影响因素报道不多。鉴于我国华南地区HCV 6a亚型的快速流行趋势,加快对6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征、抗病毒治疗疗效、预测因素以及与lb亚型的差异等研究,具有重要的临床意义。慢性丙型肝炎标准治疗方案(SOC)是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,从全球来看患者病毒学应答率在50%左右。SOC方案治疗有很多副作用和禁忌症,且花费昂贵,致使部分患者无法完成全程治疗或无法接受该治疗方案。因此,积极探索能够预测抗病毒治疗疗效的因素对患者避免治疗带来的高风险、将药物的毒副作用降低到最低以及合理的进行个体化治疗,具有重要的临床实践意义。2009年以来,全球多项研究发现人基因组编码干扰素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917位点单核苷酸多态性与聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗应答有关,这一发现标志着在HCV研究领域对宿主作用的认识进入新的阶段。同时探索寻求快速、简单、可靠的IL28B多态性检测方法,也成为近年与该领域相关的研究热点之一。长期以来,HCV体外细胞培养模型研究进展缓慢。直到2005年日本学者Wakita等成功地建立了HCV 2a (JFHl)型全基因组细胞培养系统,该细胞培养体系的全长JFH1 RNA能够有效复制并分泌感染性病毒颗粒。它的构建在HCV细胞培养模型发展史上具有里程碑式的意义。由于不同HCV基因型的生物学特点及对抗病毒治疗应答存在差异,2a亚型细胞培养模型并不能满足HCV相关研究需要,随后许多学者积极探索构建其他基因型的全基因组细胞培养系统,但收获不多。近年,在JFH1细胞培养模型的基础上来进行改造,构建其他基因型与JFH1嵌合病毒细胞培养系统取得了一些进展。目前已报道的嵌合病毒细胞培养体系包括1a、1b、2a、3a、4a、2b、5a、6a、7a等,而HCV 6a犁全基因组细胞培养系统未见报道。鉴于目前HCV 6a亚型在我国华南地区快速增长和流行,并有向全国传播趋势。加快对我国6a亚型的生物学特点、疫苗研发、抗病毒药物的评价和筛选等已成为我国丙型肝炎防治研究的迫切需要。因此,有必要尽快建立我国6a亚型流行毒株细胞培养系统。研究目的基于前期我们研究团队对HCV基因型的初步研究结果,本研究旨在通过扩大样本以调查我国华南地区慢性丙型肝炎的HCV基因亚型分布情况与特征,分析该地区HCV基因亚型流行和变迁,探讨HCV基因亚型流行模式转变的原因和6a亚型病毒株的进化来源。对比分析我国华南地区HCV 1b和6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征,比较两组患者的抗病毒治疗结局差异,探讨影响病毒学应答的因素。建立一种与慢性丙型肝炎抗病毒治疗应答相关的IL28B rs8099917基因多态性检测方法,并应用该方法检测rs8099917基因型,分析该位点基因型与治疗结局的关系。利用JFH1(2a)可高效细胞培养的特性,以JFH1序列为骨架,构建HCV 6a/JFH1重组病毒,为下一步构建6a亚型全基因细胞培养系统奠定实验基础,以期为我国HCV 6a病毒株的生物学特点、相关免疫学特征、疫苗研制、抗病毒药物的评价和筛选等提供实验技术平台。研究方法1.慢性丙型肝炎的病毒基因型和亚型的分布：通过比对分析我国HCV主要流行基因亚型的序列,改进HCV基因分型引物,选择C/E1和NS5B区PCR扩增测序分型。回顾性收集患者年龄、性别、病毒载量、感染时间及传播途径等资料,多因素分析HCV基因型/亚型与这些因素的关系。2.影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒与宿主因素研究：建立华南地区1b亚型和6a亚型慢性丙型肝炎临床对照研究,所有患者应用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗48周,并随访至少24周。收集患者抗病毒治疗前临床基线资料：性别、年龄、HCV RNA定量、ALT、AST、TBIL、ALB、TG、CHOL、 GLU、WBC、NEU、RBC、PLT、HGB等资料,记录抗病毒治疗期间4、12、48周以及治疗结束随访24周时HCV RNA定量。比较分析两组患者的临床一般特征以及抗病毒治疗应答差异,分析影响病毒学应答的因素。3.与抗病毒疗效相关的IL28B多态性检测方法的建立与应用：根据四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法(T-ARMS-PCR)的原理,设计两对引物,特异性扩增鉴定IL28B rs8099917基因型,并通过直接测序和设置阳性参照评价T-ARMS-PCR方法的特异性。应用该方法对我国慢性丙型肝炎患者IL28B rs8099917基因型进行检测,对IL28B另一位点rs12979860直接测序法鉴定基因型,分析两位点基因多态性与抗病毒治疗疗效的关系。4.我国华南地区6a/JFH1重组病毒的构建：应用重叠延伸PCR方法分别扩增华南地区HCV 6a亚型Core-NS2基因和JFH1两基因片段,进行基因融合连接,酶切连接构建6a/JFH1重组病毒质粒。5.统计学方法：计数资料采用卡方检验；计量资料两组之间比较t检验或非参数Mann-Whitney U检验,计量资料三组之间比较采用方差分析；HCV基因型与相关因素的关系采用多分类Logistic回归分析；探讨慢性丙型肝炎患者获得SVR的预测因子应用二分类Logistic回归分析。P值小于0.05时有显著性差异,所有统计学分析使用SPSS13.0。结果1.388例慢性丙型肝炎患者中,检测出HCV基因型有8种：1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a和6d,各种基因亚型的例数分别为5例(1.3%)、230例(59.3%)、31例(8.0%)、1例(0.3%)、30例(5.2%)、16例(4.1%)、84例(21.6%)和1例(0.3%)。2.不同HCV基因型患者的平均年龄有显著性差异(p0.001)。与6a亚型患者相比,感染1b和2/3型患者的平均年龄大(34.9±8.6岁vs.42.7±15.3岁和40.2±10.7岁)。在大于25岁以上年龄组中,1b亚型的比例随年龄增大有增多趋势,而6a亚型的比例有随年龄增大有减少趋势。3.不同HCV基因型患者的性别分布有显著性差异(p=0.011)。感染2/3型和6a亚型的男性患者比例明显高于女性(67.6%vs.32.4%和76.2%vs.23.8%)。4.不同HCV基因型患者的传播途径有明显差异(p0.001)。通过输血或血制品感染HCV的患者中1b亚型的比例是80.5%,经静脉吸毒感染HCV患者中6a亚型的比例是63.3%。117例有明确输血或血制品时间的lb亚型患者中,1995年之前感染HCV的患者比例高达84.6%(99/117),而在1995年之后,通过此途径感染的患者比例显著下降并维持一定水平。5.多因素Logistic回归表明,HCV基因型与传播途径独立相关。1b亚型与输血或血制品途径相关(P0.001),而6a亚型与经静脉吸毒途径相关(P0.001)。6.进化树分析显示,我国华南地区慢性丙型肝炎的6a亚型病毒株与香港6a亚型病毒株有高度的相似性,二者在进化距离上与越南6a亚型病毒株更接近。7.本研究共纳入47例lb亚型和41例6a亚型慢性丙型肝炎患者,两组患者在抗病毒治疗前的性别分布、平均年龄,以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白、总胆红素、甘油三酯、胆固醇、血糖、白细胞、中性粒细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、HCV RNA定量等水平差异无统计学意义(P值均大于0.05)。8.88例慢性丙型肝炎患者,总体SVR率为71.6%(63/88)。与lb亚型患者相比,6a亚型患者有较高的RVR和SVR(92.7%vs.66%,P=0.002和85.4%vs.59.6%,P=0.007)；但两组患者的EVR和ETVR无显著性差异(95.1%vs.87.2%,P=0.362和95.1%vs.91.5%,P=0.802)。9.多变量Logistic回归分析影响SVR的因素表明,在抗病毒治疗前,HCV基因型(0R=3.59,P=0.036)和患者年龄(0R=0.92,P=0.001)独立与SVR相关；而治疗开始后,患者年龄(0R=0.88,P=0.001)和RVR(OR=17.24, P=0.012)与SVR独立相关。10.本研究建立了IL28B rs8099917基因分型方法即T-ARMS-PCR法,应用该方法对56例HCV 1b亚型慢性丙型肝炎患者的rs8099917基因分型结果与直接测序较为一致,特异性为(98.2%)。T-ARMS-PCR法是一种快速、简单、有效的rs8099917基因分型方法。11.56例1b亚型慢性丙型肝炎患者中,rs8099917位点的TT基因型的比例为80.4%(45/56),TG基因型的比例为19.6%(11/56),未检测到GG基因型。携带TT基因型患者获得病毒学应答率显著高于携带TG基因型患者(68.9%vs.27.3%,p=0.029)。测序结果表明,rs12979860与rs8099917位点基因型有高度的关联性。12.本研究构建了6a/JFH1重组病毒质粒,转染Huh7.5.1细胞后,复制效力较低,需进一步改造,筛选适应性突变病毒株。结论1.华南地区慢性丙型肝炎患者中存在8种不同HCV基因亚型：1a、1b、2a、 2b、3a、3b、6a和6d。该地区主要流行的HCV基因型是1b亚型,其次为6a亚型。华南地区HCV基因型的流行模式呈现新特点：与输血或血制品途径相关的lb亚型患者比例有减少趋势,而与静脉吸毒途径相关的6a亚型患者比例有增多趋势。2.1b和6a亚型两组慢性丙型肝炎患者治疗前临床基线特征相似,但两组患者的抗病毒治疗结局不同：与1b亚型相比较,6a亚型患者能够获得有较高的SVR率。在抗病毒治疗前,HCV基因型是预测SVR的主要因素；而抗病毒治疗开始后,RVR是预测SVR的主要因素。3.四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法(T-ARMS-PCR)是一种快速、简单、有效的IL28B rs8099917基因分型方法。携带rs8099917 TT基因型患者比TG基因型患者有较高病毒性应答率。我国慢性丙型肝炎患者人群中rs8099917与rs12979860位点高度关联。4.本研究成功构建了6a/JFH1重组病毒质粒,为构建6a亚型全基因组细胞培养体系奠定了实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63

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