普通棉耳绒猴MHC-I型基因多态性特征分析

发布时间：2018-10-04 18:22

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染人体后可以引起丙型肝炎,是造成人类肝病的一个主要原因。丙型肝炎在全世界范围都有报道,国际卫生组织统计,全世界大约有1亿8千万人受到了丙型肝炎病毒的感染,并以每年新增3.5万人的速度在增加。丙型肝炎病毒具有严格的种属特异性,只有人类和黑猩猩可以被丙型肝炎病毒感染,而黑猩猩成本昂贵,加之伦理学等因素,极大的限制了丙型肝炎病毒动物感染模型的建立。因此,人类一直处于一个缺乏丙型肝炎病毒动物感染模型的境地,极大的限制了开发新型抗病毒药物以及疫苗的研究。虽然科学家一直致力于丙型肝炎病毒的研究,来预防和治疗丙型肝炎持续感染,但是丙型肝炎病毒感染的分子机制一直没有被明确的阐述。GB病毒-B (GBV-B)的出现使很多研究HCV的学者开始注重另一项研究,就是开发一种GBV-B感染小型灵长类动物替代模型,来模拟HCV在人类体内感染的过程。 GBV-B是一种与丙型肝炎病毒(HCV)非常相近的病毒,同属黄病毒科肝病毒属。这种病毒早在40年前被描述,它是将处在HCV感染急性期的病人血清注射到绢毛猴体内,经过一段时间后,将这只绢毛猴血清继续注射到另外一只健康的绢毛猴体内,这样经历了很多次传代后,从绢毛猴体内得到的一种可以感染绢毛猴并可以引起肝炎的RNA病毒。除了绢毛猴,GBV-B还可以感染绒科动物中的普通棉耳绒猴。引起它们类似人类肝炎的症状。有一些学者还构建了HCV/GBV-B嵌合病毒,将HCV的5'-NCR、HVR1、p7等小基因片段(212bp),甚至是HCV完整结构蛋白基因替换到GBV-B中,用嵌合病毒感染普通棉耳狨猴,希望能够更准确真实地模拟HCV在灵长类动物体内的活动状态。普通棉耳绒猴属新世界小型灵长类动物,与绢毛猴同属绒科。普通棉耳狨猴可以被GBV-B感染并产生类似人类肝炎的症状。因此,可以用来作为一种替代模型来研究丙型肝炎病毒的感染。这种小动物具有体小(成年体重350g到400g)、繁殖率高、进食少、费用相对于黑猩猩低、易在实验室内笼养等优点。作为实验动物模型,清楚的主要组织相容性复合体多态性信息是必不可少的,尤其是I型主要组织相容性复合体与T细胞介导的免疫反应密切相关。目前我们对普通棉耳狨猴的主要组织相容性复合体多态性信息的了解却知之甚少。 Ⅰ型主要组织相容性复合体具有高度的多态性,在T细胞介导的免疫反应中,起到了识别病原体的功能。另外,在CD8阳性的T细胞免疫反应中,对于病毒的清除存在着明显的个体差异,有些个体会自然清除,而有些个体却会持续感染,在这个现象中,个体之间存在着不同的Ⅰ型主要组织相容性复合体等位基因是主要的一个因素。因此,作为实验动物,清晰的Ⅰ型主要组织相容性复合体多态性背景资料是必要的。普通棉耳狨猴的种系相对来说比较单纯,很适合用来研究主要组织相容性复合体介导的T细胞免疫反应。到目前为止,对于普通棉耳狨猴Ⅰ型主要组织相容性复合体的等位基因的研究还很有限,只有少数几条等位基因被发现。在本研究中,从9只用来研究HCV/GBV-B绒猴感染模型的普通棉耳狨猴中分离出了Ⅰ型主要组织相容性复合体全长基因并对这些基因进行了比对分析。首先,利用TRIzol将绒猴总RNA从绒猴的外周血单个核细胞中分提取出来,并妥善保存。设计并合成了两对针对绒猴Ⅰ型主要组织相容性复合体的引物,这两对引物是来自文献中报道的扩增恒河猴Ⅰ型主要组织相容性复合体的引物。利用RT-PCR的方法,成功的从绒猴总RNA中扩增出了全长的Ⅰ型主要组织相容性复合体基因。扩增产物全长约1100bp,采用了1%凝胶电泳的方法进行了鉴定,将大小正确的片段采用切胶回收的方式进行纯化后,将纯化过的扩增产物连接至PMD-T载体上,并转化至感受态细胞TOP10,挑取单克隆,酶切鉴定后并将所有的阳性克隆送往华大基因公司进行测序。利用DNAMAN5.2.2软件对序列进行比对,并将核苷酸序列翻译为氨基酸序列,利用MEGA4.1软件制作系统进化树进行分析。进化树采用从Genbank中下载的其他灵长类动物的Ⅰ型主要组织相容性复合体的等位基因作为参考序列。参考序列包括普通棉耳绒猴的MHC class I:Caja-A (xr_091099.1), Caja-B (xm_002764215.1), Caja-C (xm_002763560.1), Caja-E (ef014284.1), Caja-GOl (u59637.1), Caja-G03(u59639.1), Caja-G04(u59640.1), Caja-G05(u59641.1);人类的MHC class I:HLA-A (nm_002116.7), HLA-B (nm_005514.6), HLA-C (nm_002117.4), HLA-E (nm_005516.5), HLA-F (nm_018950.2), HLA-G (nm_002127.5),恒河猴：Mamu-A (gu592059.1), Mamu-B (ef580173.1), Mamu-E (nm_001114966.1), Mamu-F (nm_001042770.2),以及黑猩猩：Patr-A (dq539672.1), Patr-B (dq539675.1), Patr-C (afl65370.1), Patr-E (nm_001045498.1), Patr-F (nm_001129198.1), Patr-G (nm_001045512.1)。本研究新发现的绒猴Ⅰ型主要组织相容性复合体的等位基因提交NCBI Genbank后递交免疫多态性数据库(IPD)进行命名。本研究中,共挑选了355个阳性质粒测序,这些克隆分别来自9只绒猴,每只绒猴所提供的克隆数从15到92个不等。由于试验方法的限制,为了确保这些克隆并非是由于人为原因产生的变异,我们确立了一个选取阳性克隆的方法,即单倍型克隆数≥2才可以认为是确实存在的等位基因,基于此规则,从9只绒猴中,共发现了26条新的MHC-I等位基因。并对这26条等位基因以及24条参考序列进行了系统进化树的分析。在26个新发现的等位基因中,有15个Caja-G等位基因,并且他们可以翻译成完整的功能蛋白。另外11个等位基因是假基因,其中6个为Caja-C假基因和5个为Caja-G假基因。这些假基因由于编码框移位或者是碱基缺失,导致其不能翻译成完整的功能蛋白。另外,有6个假基因都恰巧缺失了编码α2蛋白的基因。将15个Caja-G等位基因提交Genbank获得序列号并递交IPD进行命名。在这些序列中,2条序列m01-caja-a16和m13-caja-a09分布在3只绒猴中,5条序列分布在2只绒猴中,剩下的8个等位基因均出现在1只不同的绒猴个体中。并没有发现一条等位基因出现在所有或者大部分的绒猴中。新发现的Caja-G等位基因与Genbank中的Caja-G参考序列相似度高达96%。在Genbank中,目前只有少数几条Caja-G序列,因而Caja-G等位基因还应该被更精确的进行详细划分。将这15条新发现的可以翻译为完整功能蛋白的等位基因利用DNAMAN软件翻译为氨基酸序列。并进行两两相比。这15条等位基因可以翻译成两种大小的功能蛋白,一种大小为359个氨基酸,另一种大小为362个氨基酸。而所有这15条等位基因核苷酸两两相比后相似度为89.54%到99.91%,氨基酸两两相比后相似度为83.51%到100%。m13-caja-a09和m15-caja-a06这两条等位基因具有不同的核苷酸序列,但可以翻译成相同的蛋白。根据Ⅰ型主要组织相容性复合体分子的重链部分不同的功能,可以将其分为五个区域,包括三个胞外区(分别记作α1,α2和α3),一个跨膜区以及一个胞浆区。Ⅰ型主要组织相容性复合体多态性主要集中在α1,α2区域中,在本研究中新发现的等位基因氨基酸序列中,高变区主要集中在三处,分别是第62到83位氨基酸,第92到121位氨基酸以及第152-179位氨基酸,而人类HLA超高变区的位置分别位于第62到83位氨基酸,第92到121位氨基酸以及第135到157位氨基酸。这些区域的高度多态性是非常重要的,因为这些区域所编码的蛋白共同组成了Ⅰ型主要组织相容性复合体分子的肽结合位点。另外,在a3中有一处非常保守的位点,包含有7个氨基酸,这7个氨基酸与CD8阳性细胞结合位点相关。总而言之,本课题通过对9只普通棉耳绒猴进行研究,新发现了15个新的Caja-G等位基因,这15个等位基因可以翻译Ⅰ型主要组织相容性复合体完整的功能蛋白。同时还发现了6个Caja-C假基因以及5个Caja-G基因。说明了绒猴这一物种具有高度的MHC class I基因多态性,这些研究资料增加了我们对绒猴MHC遗传背景的认识。而且还为HCV/GBV-B绒猴感染模型中的CD8+T细胞免疫反应研究提供了非常有用的信息。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63

【共引文献】