HBV通过激活NLRP3炎性体促进IL-1β产生的作用及机制研究

发布时间：2018-09-19 20:59

【摘要】：研究背景 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)简称乙肝病毒,是一种小环型部分双链DNA病毒,其基因组至少包含S(包含S基因、PreS1基因和PreS2基因)、C、X、P等4个开放读码框架,分别编码包膜抗原(HBs)、核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)和DNA聚合酶。HBV属于嗜肝病毒属,但没有直接的肝细胞毒性,病毒感染后引发的免疫性肝损伤是其致病的重要机制,HBV感染后可进一步导致肝硬化或肝细胞肝癌的发生。据统计,目前全世界HBV感染人数已超过4亿,每年约100余万人死于HBV相关肝病,因HBV相关疾病死亡的人数占全球40%左右,因此,HBV是目前危害人类健康的主要杀手之一,但HBV感染致免疫性肝损伤的作用尚不十分清楚,其致病机制亟待于深入探讨。 长期以来,多数学者认为HBV的成功清除与体内较强的特异性细胞免疫应答有关,然而,越来越多的证据表明固有免疫在HBV感染及致病过程中发挥重要作用,明确HBV感染引发的免疫效应及分子机制对于HBV相关肝病的诊断和治疗极为关键。研究发现,HBV感染后是由肝脏非实质细胞识别,主要由枯否氏细胞(Kupffer cell,KC)识别。KC是肝脏中定居的巨噬细胞,占全身巨噬细胞总数的80%-90%,是体内最大的巨噬细胞群,也是肝内主要的炎性反应细胞和细胞因子来源,KC通过产IL-1β、IL-18等炎症因子参与各种慢性肝病过程中肝损伤的发生与发展。 IL-1β和IL-18的产生依赖于炎性体的激活。炎性体(也称炎症小体)是Tschopp等于2002年首次发现并报道的,第-个被发现的炎性体是NLRP1炎性体。随着研究的深入,陆续发现的炎性体有NLRP3(或NALP3).NLRC4.AIM2、RIG-I炎性体等,其中,NLRP3炎性体被研究得最多,NLRP3分子通过接头蛋白ASC招募Caspase-1,从而组成多蛋白复合物即NLRP3炎性体。多种病毒感染可介导NLPR3炎性体的活化,NLRP3炎性体即可感应RNA病毒如流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV),也可感应DNA病毒如腺病毒、水痘-带状疱疹病毒,由此说明无包膜的小分子DNA病毒或有包膜的大分子DNA病毒都可调节NLRP3炎性体的活化。炎性体的激活可使Caspase-1活化进而对IL-1β或IL-18前体进行剪切,促进IL-1β或IL-18的成熟和释放,引起炎症反应。 文献报道,IL-18、IL-1β启动子基因多态性与HBV感染后的疾病进程及预后密切相关,HBx蛋白和HBc蛋白可诱导IL-18的产生,慢乙肝患者血清中IL-1β的水平显著高于正常人,且乙肝患者体内IL-1β的水平与HBV病毒滴度呈正相关。那么HBV如何调节IL-1β和IL-18的产生呢?目前尚未见相关研究的报道,本文首次探讨了HBV对NLRP3炎性体的调节作用。 T细胞免疫球蛋白域黏蛋白样蛋白(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain, Tim)家族是McIntire于2001年发现并鉴定的与哮喘和过敏性疾病相关的一个新基因家族。小鼠Tim基因家族位于染色体11B1.1,目前共发现8个基因,编码蛋白Tim-l-Tim-4和4个假想基因Tim-5-Tim-8。人类TIM家族只有3个基因,定位于染色体5q33.2,分别编码蛋白TIM-1、TIM-3、TIM-4。Tim蛋白是一类具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其结构包括免疫球蛋白(IgV)样区、黏蛋白(Mucin)样区、跨膜区和胞内区。除Tim-4外,Tim-1、Tim-2、Tim-3胞内区均含有酪氨酸激酶磷酸化位点,直接参与胞内信号转导。 Tim-4分子在免疫调节及维持机体稳态中具有重要作用。Tim-4是Tim-1的天然配体,主要表达在活化的抗原提呈细胞表面,能维持腹腔巨噬细胞平衡,Tim-4与Tim-1相互作用可为T细胞提供协同刺激信号,Tim-4对T细胞的活化具有双重调控作用,而Tm-4对巨噬细胞具有负调控作用。课题组前期研究发现,Tim-4过表达可抑制LPS诱导的IL-1β产生,在ConA诱导的小鼠肝炎模型中,发现转输Tim-4过表达的巨噬细胞系可抑制IL-1β的产生,提示Tim-4可能抑制炎性体的活化。另外,发现慢乙肝患者PBMCs、HBV转基因小鼠肝单个核细胞中Tim-4的表达水平显著减低,那么HBV如何调节Tim-4的表达,是否通过调节其启动子活性进而影响其表达呢?HBV是否通过调节Tim-4的表达影响NLRP3炎性体的活性呢? 本文基于相关问题进行了初步探讨。 研究目的 明确HBV对NLRP3炎性体活性的影响,并初步探讨其作用机制；构建人TIM-4启动子报告基因载体并鉴定其活性；探讨TIM-4对NLRP3炎性体活性的影响。 方法 第一部分：HBV对NLRP3炎性体活化的影响 1临床标本检测 (1)收集慢乙肝患者及健康对照血浆标本 收集了56例慢乙肝患者的初诊病人和20例健康对照组的肝素抗凝血，，离心取取上清,-20℃保存。 (2)ELISA检测血浆中IL-1β的水平 利用ELISA试剂盒检测初诊的慢乙肝病人以及健康对照组的血浆中IL-1β的水平。 2.动物实验 (1)H3V转基因小鼠及正常对照 取鉴定为阳性的8-12周龄的HBV转基因小鼠(Balb/c)35只,以及由山东大学动物中心提供的,12只同龄Balb/c小鼠为正常对照。 (2)HBV转基因小鼠血清DNA及抗原的检测 分批处死HBV转基因小鼠,摘眼球取血，温放置2h,4℃离心收取上清,检测HBV DNA及表面抗原。 (3)ELISA检测血清中IL-1β的水平 用ELISA试剂合检测HBV转基因小鼠与健康对照鼠血清中的IL-1β (4) Western blot检测小鼠肝组织中Caspase-1的活化 随机选取14例HBV转基因小鼠及s猿６哉招∈蟮母巫橹

本文编号：2251322