高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠病理损伤特征及补体介导的免疫病理损伤机制研究

发布时间：2018-10-19 20:01

【摘要】：目的:目前人高致病禽流感H5N1病毒引起的高病死率和新发人禽流感病毒的频繁出现对公共卫生提出了严峻挑战。人禽流感病毒感染后的生理和病理特征仍需进一步探讨，不同人禽流感病毒的感染损伤特征及宿主反应分析仍需研究。此外，免疫病理损伤在人禽流感病毒感染致病中的分子机制仍然没有充分系统的认识，尤其是对补体介导的免疫病理损伤作用及机制缺乏了解。为此，本研究建立高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，同时对比分析H5N1、H7N9及H1N1病毒感染小鼠后的病理损伤特征及宿主反应。此外应用H5N1病毒感染小鼠模型系统阐明补体介导的免疫病理损伤的致病作用及分子机制，以期为防治新发人禽流感病毒及探索新的免疫治疗策略等提供参考。方法:（1）高致病性H5N1病毒感染小鼠模型建立：生物安全三级实验室内滴鼻感染20μl10LD50H5N1病毒感染小鼠，对照组同样方法接种PBS。观察小鼠生命状态及体重变化、生存时间及存活率。感染后1天、3天和5天分别处死小鼠，检测H5N1病毒感染组织嗜性及组织中病毒分布及滴度，苏木素-伊红（HE）染色检测小鼠各组织病理变化；免疫组化技术检测肺组织中性粒细胞表达及浸润程度；ELISA技术检测感染后血清白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）和肺组织匀浆液中的髓过氧化物酶（MPO）的表达变化；荧光实时定量PCR技术检测肺组织中干扰素反应水平变化。（2）不同流感病毒感染小鼠损伤特征比较分析：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，对比分析各小鼠模型不同流感病毒感染后存活率和体重变化、分析小鼠组织病理损伤、病毒复制和抗原分布差异，感染后中性粒细胞表达变化，及免疫组化技术检测增殖细胞核抗原（PCNA），旨在对比分析各流感病毒的致病性及以宿主针对不同流感病毒感染后的自身修复能力。（3） H5N1病毒感染后补体激活研究：在H5N1病毒感染所致严重肺炎的小鼠模型中，分别使用免疫组化技术检测补体成分C3和C5b-9在肺组织的沉积和补体受体C3aR和C5aR及凝集素途径MBL-c成分的表达变化，使用荧光实时定量PCR技术检测C3aR、C5aR和MBL激活相关丝氨酸蛋白2（MASP2）的转录水平的表达变化，以评价小鼠模型在H5N1病毒感染后补体的激活情况。（4）抑制补体激活在H5N1病毒所致肺炎的保护作用研究：在H5N1病毒建立的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症（ALI/ARDS）模型中，分别使用眼镜蛇毒因子（CVF）降低机体补体的整体水平，C3aR抑制剂（C3aRa）阻断C3a与C3aR结合以及抗小鼠C5a抗体封闭C5a活性等方式抑制补体过度激活，实验共分为4组：①CVF干预组：在感染前24h和48h分别腹腔注射CVF（2.5μg/只/次）；②C3aRa阻断组：在感染后立即尾静脉注射C3aRa（1mg/kg）；③Anti-C5a Ab阻断组：在感染之后立即尾静脉注射Anti-C5a Ab（400ug/只），④H5N1病毒感染未治疗组。对比观察各组小鼠存活率及生命状态，检测小鼠肺组织病理损伤差异及炎症细胞数量及炎症因子及干扰素反应水平差异，评价抑制补体激活在H5N1感染所致严重肺炎中的保护作用。结果：（1）高致病性禽流感H5N1病毒感染小鼠模型研究。小鼠感染H5N1病毒后所呈现出的生命状态、生理病理特征以及炎症反应均与临床H5N1病毒感染患者的ALI/ARDS相似，主要体现为：小鼠活动力明显减弱，体重减轻；出现倒毛、弓背等现象；从第7天开始死亡，10d内小鼠全部死亡，死亡率达100%；在病毒感染小鼠之后能够检测病毒在肺组织存在并复制，感染早期存在于气管和支气管腔，晚期浸润到肺泡腔和肺间质内，多数小鼠脑内也能分离到病毒。病毒感染后主要损伤器官为肺组织，感染早期肺支气管上皮细胞脱落、坏死，感染后期肺组织出现弥漫性损伤，肺泡腔塌陷、组织大量充血水肿。感染后肺组织出现显著的炎症反应，中性粒细胞增多并且在感染后期浸润到肺泡腔内，中性粒细胞分泌的MPO表达明显增多，血清中致炎细胞因子IL-6和TNF-α也发生上调，小鼠肺组织IFN-γ表达增强，IFN-α/β R表达水平下降。（2）不同流感病毒感染小鼠损伤特征分析研究：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，对比分析不同流感病毒感染后的小鼠损伤特征，主要表现为：H7N9病毒感染后小鼠无死亡，H5N1和H1N1病毒感染后小鼠均全部死亡，但H5N1病毒小鼠存活时间更短；三种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和少量间质细胞。H7N9病毒感染小鼠肺组织呈现脉管炎和间质炎的病理特征，脾脏偶见轻微病变；而H5N1和H1N1病毒感染后小鼠肺组织呈现ARDS的典型病理特征，并且H5N1病毒的肺损伤更为严重，两者脾脏炎细胞均明显增多。H7N9病毒感染之后宿主炎症反应较小，感染后小鼠肺组织自我修复能力较强；H5N1和H1N1病毒感染小鼠后机体炎症反应强烈，感染后恢复能力差，其中H5N1病毒感染炎症最为明显，恢复能力最差。（3）H5N1病毒感染小鼠后补体激活研究：H5N1病毒感染小鼠后小鼠补体成分C3和C5b-9在肺组织沉积明显增多，补体受体C3aR和C5aR表达明显上调，其中感染早期补体成分及受体主要沉积和表达在支气管腔上皮细胞，感染后期在肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等大量沉积和表达，并且发现凝集素途径中的MBL-c沉积及MBL活化相关的丝氨酸蛋白2的表达也明显增强。使用实时定量PCR检测到C3aR, C5aR和MASP2转录水平同样在感染后升高，其中C5aR和MASP2升高更为明显。提示补体在H5N1病毒感染后大量激活，其中凝集素途径是重要的病毒感染后的补体激活途径。（4）抑制补体激活在H5N1病毒所致严重肺炎中的保护作用研究：分别使用CVF降低机体补体的整体水平，C3aRa阻断C3a与C3aR结合以及抗小鼠Anti-C5aAb封闭C5a活性等方式抑制补体过度激活，与未治疗组对比分析，在抑制补体激活之后，小鼠的存活时间明显延长，死亡率降低，小鼠的活动力增强，生命状态改善，治疗后小鼠在感染后期均未出现严重肺炎的病理特征，仅出现肺间隔增宽，小灶性肺泡腔塌陷等。另外，抑制补体激活后有效降低H5N1病毒感染所致炎症反应，主要体现为中性粒细胞浸润程度降低，，肺组织MPO表达降低，血清中TNF-α因子下降及宿主II型干扰素反应降低。以上结果提示抑制补体激活能够降低炎症反应，有效减轻H5N1病毒感染所致的肺组织病理损伤。结论:本研究成功建立了高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，并详细评价感染后小鼠的病理生理特征和炎症变化，同时对比分析了不同流感病毒的感染特征和损伤特征的差异，明确了流感病毒毒力及宿主反应的差异。此外，应用H5N1病毒感染小鼠模型阐明了补体介导的免疫病理损伤致病作用及分子机制，并采取不同的补体抑制方式探索基于补体为治疗靶点的免疫治疗策略研究。该研究为探讨人禽流感病毒感染损伤特征及致病机制，探索预防和治疗新发人禽流感病毒的新的免疫治疗策略研究奠定基础。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R511.7

【参考文献】