B、C型HBV核心蛋白细胞毒T细胞表位筛选以及功能意义研究

发布时间：2018-10-31 14:34

【摘要】：乙肝病毒(HBV)为一类嗜肝性病毒,在世界范围内广泛流行,在中国HBV感染情况更为严重。HBV感染对人类健康具有极大的威胁,也给人类社会造成重大的损失。研究认为特异性细胞毒T细胞(CTL)反应在清除HBV感染的过程中发挥着极其重要的作用。HBV感染后引起的CTL反应是一把双刃剑,既起着病毒清除的作用,但同时又造成了肝损伤。而病毒为了维护自身的生存会通过产生各种突变体来对抗机体的清除作用,且HBV突变被证明与乙肝疾病发展有着一定的关系。因此,HBV感染中CTL反应相关研究具有重要的理论及实际意义。 目前已报道的CTL表位主要是由西方学者发现的,但西方国家与亚洲国家主要流行的HBV基因型并不相同。基于这个情况,我们选取中国分布最多的B型和C型HBV作为研究对象,并选择了HBV组成成分中保守性最好且免疫原性最强的核心蛋白(HBc)作为研究目标。通过总结分析NCBI上171条B型HBc序列和159条C型HBc序列,利用overlapping方法合成涵盖HBcl-150全序列的九肽(每条多肽与相邻多肽有8个氨基酸的重复),若某一氨基酸的突变率超过10%,覆盖该突变氨基酸的一系列多肽也被包括在合成的范围内,合计共191条九肽。首先通过T2细胞结合实验,筛选到四条HLA-A2高结合力的多肽(HBc60-68*,HBc123-131,HBc123-13l*,HBc141-149).随后通过晶体结构学研究显示这四条多肽具有典型的HLA-A*0201表位的结构特点,但同时也具有一些新的特点,从而拓展了人们对MHC-多肽复合物结构特点上的认识。其中HBc第60位突变(L60V)产生的新CTL表位(HBc60-68*,V60),引起我们极大的兴趣,并对这一突变位点进行了深入的研究。通过晶体学方法和功能学实验相结合的策略,证明V60具有典型的HLA-A*0201表位多肽的结构特征,在小鼠体中可以产生很强的特异性CTL反应,而其野生型多肽L60并不可以。通过分析HBV感染患者的临床资料,观察到HBc L60V突变与临床更强的肝损伤,更高病毒水平以及不良预后相关。随后通过在HLA-A2.1/HBV杂交小鼠中进行V60多肽免疫,我们证明V60刺激起的多肽特异性CTL反应在杂交小鼠中造成了一定的肝损伤。另一方面,我们在野生型HBV质粒中引入HBc L60V突变,在质粒转染Huh7细胞后检测发现,突变型质粒的HBV复制水平明显高于野生型质粒,高压尾脉注射野生型HBV质粒与突变型质粒进入小鼠体内也得到了同样的实验结果。我们进一步通过细胞内和原核表达野生型及突变型HBc蛋白,发现在同等HBc蛋白表达量的情况下,突变型HBc蛋白包装成核心颗粒的水平要明显高于野生型蛋白,这就说明了HBc L60V突变可能通过促进HBc核衣壳的包装来促进HBV复制,而这个结果也解释了含有HBcL60V突变的慢肝病人中HBV DNA水平更高的现象。本实验中我们展示了一种新型HBV突变行为,该突变以产生一个新HLA-A2限制性CTL表位的代价而促进了HBV复制。我们的实验结果表明HBc L60V突变影响了T细胞反应,HBV复制以及艺肝疾病发展,有助于人们对临床乙肝疾病发生机制的了解。
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【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62

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本文编号：2302551