miR-638靶向抑制MAPK14表达调控BCG与巨噬细胞免疫应答反应

发布时间：2018-11-22 16:13

【摘要】：目的研究micro RNA-638通过调节MAPK14的表达,参与BCG引起的炎症反应的调控机制。方法1.通过mi Randa、Targetscan和Pic Tar等靶基因预测软件对micro RNA-638(mi R-638)可能的靶基因进行生物信息学预测。预测结果显示,与固有免疫应答关系密切的MAPK14是理想的研究靶基因,本课题拟将MAPK14的3'UTR构建到p MIR-Report表达载体中,同时应用脂质体转染法将过表达mi R-638及抑制mi R-638表达的质粒分别与p MIR-Report-MAPK14重组质粒共转染到293T细胞中,应用双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶作为参照,进行荧光素酶检测,以此验证mi R-638与MAPK14之间的靶向作用关系。2.根据最新mi RBase数据库人源mi R-638(mi RBase NO:MI0003653)的基因序列,化学合成含有mi R-638成熟序列的短发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA),并构建入穿梭载体p Sico R质粒中,经双酶切及测序鉴定,利用脂质体转染法将鉴定为阳性的重组质粒与p CMV-VSV-G、p CMV-d R8.91两个质粒共转染到293T细胞中,包装过表达mi R-638的慢病毒,并测定病毒滴度;另外合成mi R-638 inhibitors(23 nt 2’-甲氧修饰的RNA寡核酸,能有效抑制成熟mi R-638的表达)。3.将包装成功的LV-mi R-638慢病毒及mi R-638 inhibitors分别侵染THP-1细胞诱导分化成的巨噬细胞,24h后再应用BCG刺激细胞12h,收集细胞及细胞上清液,提取micro RNAs、m RNA和全蛋白,应用Real-Time PCR检测mi R-638表达水平及MAPK14的m RNA的表达水平,应用Western Blot检测MAPK14蛋白的表达水平。应用ELISA检测细胞上清液的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的蛋白表达水平。结果1.通过生物信息学软件预测,最终我们选定了在p38MAPK信号通路中发挥重要作用的MAPK14作为研究的靶基因。通过双荧光素酶报告基因系统证实了mi R-638可以靶向结合MAPK14 3’UTR的作用位点并抑制其表达;转染了p Sico R-mi R-638过表达载体组,MAPK14的相对荧光素酶活性与突变体的活性相比下降约5.5倍(P0.05),与正常对照组相比下降约6.1倍(P0.05);而转染了mi R-638 inhibitor组,MAPK14的荧光素酶活性与突变体的活性相比有所升高,与p Sico R-mi R-638过表达载体组相比升高约6.6倍(P0.05)。2.成功构建了p Sico R-mi R-638慢病毒表达载体,并成功包装慢病毒以及病毒滴度的测定,测定结果显示病毒滴度达1x106TU/m L3.mi R-638表达量的检测结果证实,转染重组载体p Sico R-mi R-638后mi R-638表达上调31.2倍(p0.05),转染mi R-638 inhibitors后mi R-638表达量与正常对照组相比下调20.2倍(p0.05)。结果表明p Sico R-mi R-638重组慢病毒可以在巨噬细胞内过表达成熟的mi R-638,从而显著上调mi R-638的表达水平;mi R-638 inhibitors可以抑制巨噬细胞内mi R-638的表达。MAPK14 m RNA Real-Time PCR结果显示:过表达mi R-638后MAPK14 m RNA的表达水平较正常对照组相比下调50.1倍(p0.05);抑制mi R-638表达后MAPK14 m RNA的表达水平较正常对照组相比有所上调。Western blot分析结果显示:p Sico R-mi R-638重组质粒转染细胞后,MAPK14蛋白表达量较正常组明显降低,抑制mi R-638表达后MAPK14蛋白质表达量增加,而BCG刺激三组细胞后MAPK14的蛋白表达量都有所增加。通过ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-12的表达,来观察mi R-638对MAPK14的下游细胞因子的影响,评价mi R-638对p38MAPK信号通路炎性反应的调控。结果显示,转染p Sico R/mi R-638后巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表达显著性降低,而转染mi R-638 inhibitors后巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表达显著性升高。这些结果表明mi R-638可以通过靶向作用MAPK14的表达,影响下游细胞因子的表达,在p38MAPK信号通路中起到负向调控作用。结论1.成功包装了高滴度的、可过表达mi R-638的慢病毒颗粒,并证实mi R-638可以通过作用于MAPK14的3'UTR来抑制其表达。2.mi R-638可以通过靶向调控MAPK14的表达,直接影响p38/MAPK通路下游细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的表达,介导其炎性反应,负向调控BCG与巨噬细胞的免疫应答反应。MAPK14作为p38MAPK信号传导通路的一个关键分子,是多种炎症反应信号通路向下游传导的核心环节,在病原微生物感染机体发生免疫反应过程中具有重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52

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本文编号：2349860