结核患者血浆细胞因子表达与临床表型及结核耐药的相关性研究

发布时间：2018-12-09 17:32

【摘要】：研究背景和目的结核病(tuberculosis,TB)至今仍是全球感染率最高的慢性传染性疾病,病死率仅次于艾滋病。据估计,目前全人类已有近1/3的人口感染了结核分枝杆菌,每年约150万人因结核病死亡。据世界卫生组织(WHO)统计,我国TB病人数仅次于印度,已高居全球第2位。诊断率低是我国结核病发展和流行的主要因素之一,目前我国TB的诊断率不足60%,肺外结核的诊断更是难上加难,综合各种手段进一步提高TB的诊断水平,做到早发现、早诊断、早治疗,无疑对我国结核病的流行病学控制和预后的改善,具有极其重要的意义。结核病的发生发展与机体的免疫系统功能有着密切的关系。超过90%的人口感染MTB后长期处于潜伏感染状态,终身不发病,机体主要通过巨噬细胞非特异性吞噬清除MTB,未被机体免疫系统清除的MTB则寄生于巨噬细胞内造成潜伏感染。潜伏感染者可在局部建立有利于调节性T细胞(regulatory Tcell,Treg)募集、存活的环境,并抑制特异性免疫应答,致使其不被彻底清除,能够保持休眠和静止状态,与潜伏感染者机体免疫系统维持一种平衡,这就是其既不发病也无法将体内MTB彻底清除的主要原因。而结核患者体内,效应细胞的抗结核活性非常弱,甚至处于"无能"状态。当潜伏感染者免疫系统功能紊乱时,其体内的MTB复活并播散,进而发展为活动性结核病。据估计,约5%～10%的潜伏感染者将发展为结核病患者,其中大多数为肺结核。肺结核的发生、发展和预后,不仅与MTB的数量和毒力有关,与宿主的细胞免疫功能也有着密切的联系。结核病的免疫机制非常复杂,T淋巴细胞介导的细胞免疫对结核病的发病和演变具有决定意义。T细胞主要分为CD4~+辅助性T细胞(helper T cell,Th细胞)和CD8~+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)两类。其中Th细胞又分为Th1型细胞和Th2型细胞,分别分泌不同的细胞因子。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18等因子促进细胞免疫,Th2细胞主要分泌Ⅱ-4、IL-6、IL-5、IL-13、IL-10等因子介导体液免疫反应。近年来关于Th1/Th2平衡与结核病的关系一直是研究的热点,结核患者体内Th1/Th2失衡及其动态演变贯穿于结核病全程,对结核病的进展、恶化、控制和预防起着决定性作用。由于结核菌属于胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用。机体抗结核感染的保护性免疫以Th1细胞介导的细胞免疫为主。据研究报道,结核病患者和结核病小鼠体内均存在Th2反应增强,Th1反应低下的现象。Th2细胞因子可以抑制单核细胞和T细胞向病灶聚集,影响结核结节的形成。研究发现,病情较轻的肺结核患者优势表达Th1型细胞因子,而病情较重的患者则优势表达Th2型细胞因子,如IL-4水平升高。据文献报道,有多种细胞因子(cytokine,CK)参与了结核病的发生与发展。机体抗结核免疫以T细胞免疫为主,效应CD8~+CTL则发挥细胞毒作用,通过穿孔素(Perforin)和颗粒酶B(granzyme B,GrB)途径直接杀伤感染靶细胞,暴露并清除胞内寄生的结核菌;效应CD4~+Th1细胞释放γ-干扰素(interferon-γγ,IFN-y)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等细胞因子,激活和趋化巨噬细胞,促进细胞向病灶处聚集,增强机体对结核分枝杆菌的抵抗力;巨噬细胞在控制、杀灭结核分枝杆菌的过程中起到重要作用,其抗菌活性受到多种细胞因子的调节。细胞因子是细胞与细胞之间信息传递的介质,细胞因子的相互作用构成了细胞因子网络,结核病的发生发展与细胞因子网络的紊乱有一定的关系。细胞因子之间存在复杂的网络关系,不同细胞因子的功能不同,相同的细胞因子也可有不同的功能,如IL-12,IL-23,IL-18和IL-27等细胞因子均能够促进IFN-y的产生,而IL-10、IL-4则抑制IFN-y的分泌。IL-6在MTB感染早期即在感染部位产生,具有抗炎和促炎的双重特性,并可增加MTB感染早期IFN-y的产量,从而增强机体的抵抗力,但也可通过抑制TNF-α和IL-18的产生促进MTB生长;IL-13对单核细胞抗炎作用和通过B淋巴细胞对人免疫应答刺激,说明它可与IL4和IL10共同引起Th2型应答效应,而从IL-13协同合成的影响看,它又可能是启动TTh1型免疫反应,说明IL-13是一种具有高度多效性的细胞因子。对于结核细胞因子表达状况的"全景式"研究非常重要,不仅有助于了解结核病的免疫发病机制,还有利于探索和开发新的结核病免疫诊断方法,并为进一步开发其免疫治疗方法开辟新的途径。目前由于研究样本的种属差异、个体差异、不同发病时期、不同严重程度、不同研究方法等,研究结果存在一定的争议。本课题为前瞻性观察研究,采用目前最先进的多细胞因子检测方法Luminex,选择21种既往文献报道在结核病的发生、发展中发挥重要作用的细胞因子(FRACTALKINE,Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor(GM-CSF),IFN-y,IL-2,IL-1β,IL-10,IL-4,IL-12(p40),IL-13,IL-1A,IL-12(p70),IL-17A,IL-5,IL-6,IL-8,IFN-y inducible protein(IP-10/CXCL-10),Macrophage Chemoattractant Protein 1(MCP-1/CXCL),MCP-3,Monocyte Inflammatory Protein 1 beta(MIP-1β),TNF-a and VEGF),检测它们在193例结核病人和84例正常对照者中的表达水平,探讨其意义。随着对其进一步了深入研究,有望找到稳定的免疫诊断指标,并为免疫干预和免疫治疗提供依据。本研究拟从下面几个方面对其进行研究。1、目的:探讨结核病患者细胞因子的表达状态,并分析其在结核病免疫发病中的作用。对象与方法:采用多细胞因子检测方法Luminex检测广州市胸科医院住院自2013年2月至2015年2月期间的193例结核病人和84例正常对照的血浆细胞因子及收集结核病人的临床资料。所有数据采用SPSS21.0软件处理,所有计量资料以均数标准差(Mean±SD)表示,组间差异采用两独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析,计数资料采以百分比表示,组间采用卡方检验,以P0.05作为显著性检验的标准。结果结核病人和健康人对照的能做对比的19个细胞因子中IL-1β、IL-6、TNF-α、FKN、IL-2、IP-10较对照组明显升高、MCP-1明显降低,差异有统计学意义。IFN-y、IL-10、IL-8、VEGF、GM-CSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-5、MCP-3、MIP-1β无统计学差异(P=0.072～0.849),但其中IL-10结核病人有升高趋势。(说明:可能由于研究试剂盒的原因部分细胞因子检测结果不理想如IL-4在患者,IL-1A在健康体检者,无法纳入分析)IL-1β:结核病人为 0.48±0.30(x±s)pg/ml,健康人为0.35±0.15(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=3.252,p=0.001)。IL-6:结核病人为1.39±1.93(x±s pg/ml,健康人为0.76±1.25(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=3.252,P=0.001)。MCP-1:结核病人为 130.32±53.62(x±s)pg/ml,健康人为153.30±96.67(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.046,P=0.043)。TNF-α因子:结核病人为 5.32±4.14(x±s)pg/ml,健康人为3.78±1.86(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=4.260,p=0.000)。FKN因子:结核病人为31.80±83.73(x±s)pg/ml,健康人为14.07±32.07(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.543,P=0.012)。IL-2因子:结核病人为 0.37±0.45(x±s)pg/ml,健康人为0.26±0.12(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=3.261,P=0.001)。IP-10因子:结核病人为 1120.33±1220.24(x±s)pg/ml,健康人为623.13±827.35(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=3.948,P=0.000)。IL-10因子:结核病人为0.52±0.94(x±s)pg/ml,健康人为0.34±0.71(x±s)pg/ml,结核病人有升高但两组间无统计学差异(t=1.807,P=0.072)。结论结核病患者IL-2、IL-6及IL-10的升高在结核病Th1/Th2免疫应答中发挥重要作用。TNF-α、IP-10、IL-1β及FKN等保护性免疫因子的升高,在调动机体清除MTB的免疫保护功能,但趋化因子MCP-1降低不利于MTB的清除,以上细胞因子的共同作用使机体在清除MTB菌的同时不会造成病理性免疫损伤,但细胞免疫的平衡紊乱对疾病的转归起着重要的作用。此外,细胞因子尤其IP-10可能对结核诊断具有很好的探索价值。2目的:探讨不同的肺部病灶、空洞、痰菌负荷量的细胞因子变化及其意义。对象与方法:第一部分中的肺结核病人进行分组:(1)无空洞组有96人年龄;有空洞组为69人。(2)按照病灶所占肺野范围分为1-2个肺野组63例;3～4个肺野组42例;和5-6个肺野组72例。(3)根据肺结核痰菌负荷量,痰检量-组有67人;痰检量+组为50人;痰检量++组为27人;痰检量≥~+++组为21人;测细胞因子及统计方法同前。结果(1)结核病人中无空洞组和有空洞组测量的20个细胞因子包括:IFN-y、IL-10、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、VEGF、FKN、GM-CSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-5、IP-10、MCP-3、MIP-1β 和 IL-1A,均无统计学差异(P=0.135～0.941)。(2)按病灶不同分组检测的20个因子有统计意义的是IL-6、TNF-α、IP-10和IL-1 A。IL-6:≤2 组 795.48±644.64(x±s)pg/ml,3～4 组 879.45±718.61(x±s)pg/ml,5 组 1641.95±1708.86(x±s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=3.812,P=0.011),多重比较发现≥5组高于≤2组和3～4组(p0.05)。TNF-α:≤2组4.39±2.28(x±s)pg/ml,3～4 组 4.62±2.70(x±s)pg/ml,≥5 组 6.82±5.80(x±s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=7.764,P0.001),多重比较发现≥5组高于≤2组和 3～4 组(p0.05)。IP-10:≤2 组 795.48±644.64(x±s)pg/ml,3～4 组879.45±718.61(x±s)pg/ml,≥5 组 1641.95±1708.86(x±s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=11.170,p0.001),多重比较发现≥5组高于≤2组和3～4组(p0.05)。IL-1A:≤2 组 4.31±15.35(x± s)pg/ml,3～4 组 2.77±15.07(x±s)pg/ml,≥5 组 20.39±69.67(x~+s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=3.230,P=0.042),多重比较未发现差异,但≥5组较其他两组有升高趋势。(3)按痰菌负荷不同分组检测的IL-6、GM_CSF、IL-12p70和IL-13有统计学差异。IL-6:-组 1.15±1.49(x±s)pg/ml,+组 1.41±1.41(x±s)pg/ml,++组1.50±2.33(x±s)pg/ml,≥+++组2.86±3.63(x±s)pg/ml,四组间有统计学差异(F=3.812,P=0.011),多重比较发现≥+++组高于-组、+组和++组(p0.05)。GM-CSF:-组 4.15±3.68(x±s)pg/ml,+组 3.02±1.64(x+s)pg/ml,++组 2.65±1.74(x±s)pg/ml,≥+++组2.98±1.14(x±s)pg/ml,四组间有统计学差异(F=2.947,P=0.035),多重比较发现-组高于+组、++组和≥++组(p0.05)。IL-12p70:-组1.27±0.73(x±s)pg/ml,~+组 2.21±4.11(x±s)pg/ml,++组 1.23±0.51(x±s)pg/ml,≥+++组 3.77±6.64(x±s)pg/ml,四组间有统计学差异(F=3.503,P=0.017),多重比较发现≥+++组高于-组和++组(p0.05)。IL-13:-组0.12±0.32(x±s)pg/ml,+组 0.48±2.35(x±s)pg/ml,++组 2.73±13.89(x±s)pg/ml,≥+++组7.21±18.74(x±s)pg/ml,四组间有统计学差异(F=3.761,P=0.012),多重比较发现≥+++组高于-组和+组(p0.05)。结论(1)细胞因子不随肺结核有无空洞而变化,提示肺结核有无合并空洞可能与免疫紊乱无明显相关性。(2)IL-6随着病灶增多或痰菌负荷增加而升高,对病情有判断价值,可能有开发为疗效、预后判断指标的潜在价值。(3)随着病灶增多,IP-10和TNF-α的保护性细胞因子及IL-6免疫抑制因子和双向调整因子IL-1A亦升高,多种因子的网络效应决定着病情变化。(4)随着痰菌负荷量,Th2型细胞因子IL-6、IL-13及Thl型细胞因子IL-12p70都有升高趋势,避免了由于过度强烈的Thl反应可能对宿主整体造成的病理免疫损害。但保护性因子GM-CSF的下降使MTB的清除下降可能是痰菌负荷增加的原因之一。总之,机体是一个复杂的免疫调整网络,随着病情的变化,免疫保护、免疫抑制的因子都在变化。3目的:从初治及复治肺结核和结核病类型(即肺结核、结核性胸膜炎、支气管结核)两个方面分组对其细胞因子进行分析,探索其特点并分析其在结核病中的作用。对象与方法:第一部分中的病人进行分组:(1)初治组有148人,复治组为23人。(2)结核病类型分组:肺结核病人有102人,结核性胸膜炎有28人,气管结核有30人。测细胞因子及统计方法同前。结果(1)按初治复治不同分组检测有统计意义的细胞因子是IL-10和TNF-α。IL-10:初治组为 0.34±0.18(x±s)pg/ml,复治组为 0.67±0.78(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.280,p=0.029)。TNF-α:初治组为3.77±1.08(x±s)pg/ml,复治组为 5.35±2.70(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.913,P=0.006)(2)按结核类型分组有统计意义的细胞因子是IL-8和MCP-1。IL-8:肺结核病人4.51±5.44(x±s)pg/ml,结核性胸膜炎病人 6.64±9.30(x±s)pg/ml,气管结核病人2.68±1.57(x±s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=3.166,P=0.045),多重比较发现气管结核病人低于肺结核病人和结核性胸膜炎病人组(p0.05)。MCP-1:肺结核病人144.44±53.97(x±s)pg/ml,结核性胸膜炎病人 125.32±45.14(x±s)pg/ml,气管结核病人108.64±43.81(x±s)pg/ml,三组间有统计学差异(F=5.965,P=0.003),多重比较发现气管结核病人低于肺结核病人(p0.05)。结论(1)TNF-α、IL10分别代表者保护性免疫及抑制性免疫,两者在结核的复发中发挥着作用。(2)结核性胸膜炎较肺结核、支气管结核CD4T淋巴细胞下降,其分泌的细胞因子相应减少,提示结核性胸膜炎免疫紊乱明显。IL-8是促炎因子,在三组间结核性胸膜炎明显升高,与结核性胸膜炎的形成机制有一定的关系。MCP-1在三组间低于肺结核组,高于气管结核组,提示三种不同类型的结核病有不同的免疫机制。(3)支气管结核IL-8、MCP三组中最低,提示患者的促炎因子和趋化因子下降,可能与支气管结核的形成有关。总之,CD4T、IL-8和MCP-1在不同类型的结核病变中有不同的免疫作用。4、目的:耐药肺结核的血浆细胞因子的表达状态及意义,并进一步从多个方面初步探索耐药的危险因素。对象与方法:第一部分中的有药敏结果的100例病人进行分组。敏感组66例;耐药组34例。临床资料及细胞因子的获得同第一部分。从各个方面耐药肺结核的危险因素进行分析。测细胞因子同前。所有数据采用SPSS21.0软件处理,所有计量资料以均数标准差(Mean±SD)表示,组间差异采用两独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析;计数资料采以百分比表示,组间采用卡方检验;等级资料组间比较采用秩和检验。首先将可能的影响因素纳入单变量Logistic Regression,然后将有统计学意义的变量(P0.10)进入二分类多变量logistic analysis,变量选择采用Backward LR法。以P0.05作为显著性检验的标准。结果4.1年龄和血沉有统计学差异,年龄:敏感组为38.83±21.45(x±s),耐药组为49.61±20.44(x±s),两组年龄有统计学差异(t=-2.281,P=0.025)。血沉:敏感组为 49.47±27.76(x±s),耐药组为 63.50±33.37(x±s),两组间有统计学差异(t=-2.035,p=0.045)。4.2初治复治的分布有统计学差异(X~2 =12.371,p=0.000)。复治比例敏感组为5.6%,耐药组为32.0%。4.3敏感组和耐药组测量的20个细胞因子分析。IL-10、IL-2 和 MCP-3 有统计学差异。IL-10:敏感组为 0.53±0.57(x±s)pg/ml,耐药组为0.31±0.13(x~+s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.980,p=0.004)。IL-2:敏感组为0.43±0.54(x±s)pg/ml,耐药组为0.28±0.09(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.291,P=0.025)。MCP-3:敏感组为 3.03±8.69(x±s)pg/ml,耐药组为0.58±1.42(x±s)pg/ml,两组间有统计学差异(t=2.317,p).023)。4.4影响耐药与否的单因素logistic回归分析年龄、血沉、复治有统计学意义,而细胞因子均未发现有意义的变量。年龄:OR值为1.023(95%CI:1.003～1.045),随着年龄的增加耐药(P=0.028);血沉:OR值为1.016(95%CI:1.000～1.032),随着血沉的增加耐药(P=0.049);复治:OR 值为 7.934(95%CI:2.199～28.629),复治越耐药(P=0.002)。4.5影响耐药与否的多因素logistic回归分析血沉:OR值为1.022(95%CI:1.003～1.042),随着血沉的增加越耐药(P=0.024);复治:OR值为8.277(95%CI:1.941～35.304),复治患者易耐药(P=0.004);细胞因子均无统计学意义。结论通过多因素logistic回归分析,结核复治和血沉升高是肺结核耐药的的危险因素。细胞因子尽管在本研究中不是耐药的危险因素,其代表的免疫状态可能是危险因素之一,但需进一步扩大样本量进行深入研究才能明确。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52

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