乙型肝炎病毒多聚酶蛋白拮抗Ⅰ型干扰素通路的机制研究

发布时间：2019-02-18 10:09

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是一种严重危害人类健康的病原体,可导致急慢性乙型肝炎、肝硬化,并与肝细胞癌的发生密切相关。目前临床上尚无特异性根治慢性乙肝的手段,一般采用核苷类药物及α干扰素(interferon, IFN)来抑制HBV复制以最大程度减轻和延缓HBV慢性感染所导致的肝脏免疫病理损伤。其中IFN-α作为具有直接抗病毒效应和免疫调节作用的细胞因子是宿主抗病毒天然免疫应答的重要组成部分,其在体内由宿主模式识别受体(Pattern Recognition Receptor, PRR)介导的通路诱生,并经由Ⅰ型干扰素效应通路发挥抗病毒和免疫调节作用。虽然大量体内外研究已证实IFN-α具有抑制HBV转录复制的作用,但是临床上慢性HBV感染患者对IFN-α治疗的应答率仅约30%,提示HBV可能存在拮抗Ⅰ型干扰素效应通路的策略。本课题组前期工作表明HBV编码的多聚酶蛋白(polymerase, Pol)具有抑制IFN-α诱导的MyD88转录的功能。本研究旨在进一步明确Pol在HBV拮抗IFN-α效应过程中的角色,在此基础上深入观察Pol对IFN-α激活的JAK-STAT (signal transducer and activator of transcription)通路的抑制作用,并揭示其中分子机制,以加深人们对HBV拮抗Ⅰ型干扰素通路及逃逸宿主抗病毒天然免疫应答机制的认识。首先在HBV复制和Pol过表达的细胞中采用荧光报告基因检测和实时荧光定量PCR确认了HBV和Pol对于IFN-α诱导的干扰素刺激反应元件(ISRE)活化及下游抗病毒基因转录的抑制作用。同时在基于高压尾静脉质粒注射的小鼠转染模型中也观察到,HBV和Pol的表达抑制了mIFN-α诱导的小鼠干扰素刺激基因(ISGs)的转录。为从生物学意义上确认HBV和Pol的表达削弱了IFN-α介导的抗病毒天然免疫应答,将VSV用作感染指示病毒行病毒保护实验,免疫荧光观察及细胞培养上清病毒滴定的结果均显示,HBV和Pol的存在显著削弱了IFN-α诱导的细胞抗VSV感染的能力。以siRNA干扰HBV复制细胞中Pol的表达后,HBV拮抗ISRE活化的能力明显减弱,确认了Pol在HBV抑制IFN-α效应过程中的重要角色。为进一步探寻Pol对Ⅰ型干扰素介导的信号转导的影响,通过免疫印迹及免疫荧光观察了Pol对信号通路相关分子表达以及IFN-α诱导的STAT分子活化的影响,发现Pol对IFNAR1、IFNAR2、JAK1、Tyk2、STAT1、STAT2、IRF9、 Importin-α5等分子的本底表达,以及STAT1-701位酪氨酸磷酸化和STAT1-STAT2异聚体的形成无明显影响,但Pol对与STAT1转录活性密切相关的STAT1-727位丝氨酸磷酸化及STAT1、STAT2的入核有显著抑制作用。小鼠高压尾静脉质粒注射模型中的结果验证了Pol对STAT1-727位磷酸化的抑制；而在IFN-α离体处理的慢性乙肝病人肝穿标本中,本研究首次证实相较未感染HBV肝细胞中STAT1和STAT2大多分布于核中,HBV感染肝细胞中的STAT1和STAT2则主要滞留于胞浆,有力地支持了细胞系内观察到的现象。进一步深入研究发现,Pol与负责调节STAT1-727位磷酸化的PKC (protein kinase C)-δ激酶蛋白的催化亚基存在相互作用,且抑制了IFN-α诱导的PKC-δ磷酸化及其与STAT1的结合。另一方面,免疫共沉淀实验结果显示Pol以浓度依赖的方式抑制了核浆运输蛋白Importin-α5与STAT1和STAT2的相互作用；GST-pull down实验和截短突变分析进一步显示,Pol与核浆运输蛋白Importin-α5存在相互作用,且Pol与Importin-α5相互作用的区段和Importin-α5与STAT1-STAT2异聚体结合的区段互相重叠,提示Pol可能通过与Importin-α5的竞争性结合阻碍了其介导的STAT1和STAT2的入核。鉴于Pol蛋白由末端蛋白(terminal protein, TP)、连接区(spacer, SP)、逆转录酶区(reverse transcriptase, RT)和RNaseH (RH)区等构成,通过构建并转染编码Pol各个结构域的质粒,确定了TP区负责抑制PKC-δ介导的STAT1-727位磷酸化,RH区则负责抑制Importin-α5介导的STAT1、STAT2的入核；TP和RH两个截短体单独表达均具有和全长Pol表达类似的抑制IFN-α信号通路的效应。综上所述,本研究确认了Pol在HBV拮抗Ⅰ型干扰素效应通路方面的作用,并揭示了Pol通过与PKC-δ和Importin-a5的相互作用抑制IFN-a诱导的STAT分子活化的机制,为IFN-a治疗慢性乙肝病人应答率低及HBV建立和维持慢性感染提供了可能的机制解释,同时为优化IFN-a治疗乙肝效果及开发新的靶向治疗药物提供了思路和理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62

【相似文献】